鸡枞菌多糖的免疫调节作用及其注射液的研制
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摘要
鸡枞菌(Termitomyces albuminosus (Berk.) Heim., TA)是四川省凉山州著名的一种食用菌,因其富含多种营养成分,味道鲜美,因而受到人们的关注。对于鸡枞菌多糖(TAP)的提取纯化及生物学活性研究国内外报道较少,以其为主原料的动物保健品或免疫佐剂目前还未见报道。本论文以TAP为研究对象,从体外、体内两个方面研究其对动物机体的免疫调节作用和机理,开发出TAP注射液,为其作为一种新型的多糖类免疫佐剂应用于临床提供试验依据。论文分为以下6个部分：
1.旨在更经济、安全、高效的分离、纯化TAP,本试验通过对提取温度、料液比、提取时间、提取次数进行单因素试验及正交试验得出最佳热水浸提工艺；通过结合超声波法和热水浸提法提取多糖；以冻融法及Sevage法除蛋白,H202氧化法脱色,透析法等方法纯化多糖；采用α-萘酚乙醇法及甲醇法对多糖进行定性,硫酸苯酚法对多糖进行定量分析。结果表明TAP热水浸提的最佳工艺为80。C、料液比1：20、提取1h,共提取2次；结合20kHz的超声波提取可显著缩短提取时间并提高多糖得率。TAP的纯化物为浅褐色膏状体,定性实验表明所得物质为多糖类物质；鸡枞菌中纯化TAP的提取率为6.69%,纯化TAP的含糖量为92.17%。2.为阐明TAP对T细胞免疫功能的影响及其作用机制,本试验将TAP体外作用小鼠脾淋巴细胞,用MTT法检测TAP对淋巴细胞的增殖作用,ELISA法检测淋巴细胞IL-4、IL-2及IFN-γ分泌量,流式细胞术检测T淋巴细胞亚群,RT-PCR法检测以上细胞因子mRNA表达量。结果表明,TAP可单独以及协同ConA或LPS促进脾淋巴细胞增殖；与ConA组比,25～100μg/mL TAP在作用72h内均能显著促进脾细胞IL-2、 IL-4及IFN-γ的分泌(P<0.01);25μg/mL TAP作用48h后可显著降低被ConA激活的脾细胞中CD4+%(P<0.01)、升高CD8+%(P<0.05),并降低CD4+/CD8+(P<0.05);50μg/mL TAP则可显著升高CD3+%(P<0.01);50μg/mL TAP在作用72h内能显著提高IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表达量(P<0.01),并使其保持较高水平。结果提示,TAP对T细胞免疫功能具有显著增强作用,T淋巴细胞是TAP的靶细胞之一。
3.为了探讨TAP对正常及免疫抑制小鼠免疫功能的影响及其机理,本试验以黄芪多糖(APS)为阳性药物,用环磷酰胺(CTX)制备小鼠免疫抑制模型,检测了不同剂量的TAP对正常小鼠的免疫器官指数、血清溶血素水平、巨噬细胞吞噬功能及对免疫抑制小鼠的以上指标和T淋巴细胞亚群、外周血IL-4、IL-2及IFN-γ,脾淋巴细胞增殖、免疫器官组织病理学变化等免疫指标的影响。结果表明,20mg/kgTAP可显著提高正常及免疫抑制小鼠的溶血素(P<0.01)、免疫器官指数(P<0.01或P<0.05)及巨噬细胞吞噬功能(P<0.01)；与模型组相比,20mg/kgTAP还可降低免疫抑制小鼠的CD4+/CD8+比值(P<0.01),并使外周血IL-2、IFN-γ水平分别上升312.3%(P<0.01)和88.38%(P<0.01),使IL-4水平降低40.30%(P<0.01),可在体外显著促进淋巴细胞增殖(P<0.01),减轻CTX引起的免疫器官病变。TAP与相同剂量的APS相比具有相当或更显著的免疫调节作用。结果显示,TAP能明显拮抗环磷酰胺对小鼠免疫功能的抑制作用,提高小鼠体液及细胞免疫功能,促进紊乱的免疫功能恢复平衡。
4.为了探讨TAP注射液的制备方法、质量控制及其稳定性,本试验在无菌条件下通过过滤除菌法制备TAP注射液,并按照注射剂的相关质量要求对其进行鞣质、PH值、无菌、热原及澄明度的检测；以硫酸苯酚法测定其多糖含量,费林试剂法测定单糖含量；另检测了强光及高热对TAP注射液的影响,通过经典恒温法初步估算TAP注射液的有效期。结果表明,TAP注射液的以上质量控制指标均符合注射剂的基本要求；其多糖含量为标示量的99.2-99.9%,未检测出含有单糖；强光和高温均能引起TAP出现不同程度的降解；TAP注射液在25℃避光下保存其稳定性较好,有效期为4.3年。
5.为了保证TAP注射液在临床使用的安全性,对其进行了急性、亚慢性毒性试验,局部刺激,过敏及溶血试验。结果表明,在急性毒性试验中TAP注射液在对小鼠162.5～6000mg/Kg体重的剂量范围内不能测出其半数致死量LD50；在亚慢性毒性试验中,25～100mg/kg TAP均未引起小鼠生理及行为异常和免疫器官病变；TAP注射液对眼结膜和肌肉无刺激性,不引起过敏和溶血反应。TAP注射液可以用于皮下或肌肉注射给药,无毒副作用。
6.为探讨TAP注射液对疫苗免疫效果的影响,以黄芪多糖(APS)注射液为阳性对照,通过间接血凝试验检测仔猪的口蹄疫抗体水平,用动物血细胞分析仪对免疫仔猪外周血白细胞总数,中性、单核细胞及淋巴细胞数进行了检测；同时又通过血凝抑制试验对新城疫弱毒苗免疫雏鸡的抗体水平及免疫器官指数进行了检测。结果表明,在口蹄疫疫苗首免后58d内,高剂量TAP能显著提高仔猪口蹄疫抗体水平和以上血液生理指标(P<0.01),此后随着时间延长这种作用逐渐减弱；在新城疫疫苗首免后35d内,中剂量TAP可显著提高雏鸡新城疫抗体水平并促进雏鸡免疫器官发育(P<0.01)。中高剂量TAP的免疫增强效果优于相同剂量的APS。
综上所述,TAP是一种良好的免疫增强剂,可以拮抗环磷酰胺对机体的毒副作用；TAP注射液安全有效,在临床上可通过皮下或肌肉注射与常规疫苗配合使用以增强其免疫效果,TAP有望成为一种新型免疫佐剂。
Termitomyces albuminosus (Berk.) Heim. is a kind of famous domestic fungus in Liangshan province in Sichuan. It is liked by many people for its abundance nutritional ingredient and delicious. The extraction,purification and biologic activity of Termitomyces albuminosus polysaccharide(TAP) have been reported a little at home and abroad, and there are no reports on animal health care products or immunologic adjuvant of TAP. In this dissertation,immunological regulation effect and mechanism in vitro or vivo of TAP were researched,and injection of TAP was prepared, it would provide evidence for clinical application as a immunologic adjuvant. The details are divided into six parts as follows:
1.To isolate and purify TAP with an economical,safe and efficient process,we chosed the best hot water diffusion technology through single factor test on extraction temperature, dosage liquor ratio,extraction time and frequency.The protein in TAP was removed by freeze thawing and Sevage method,pigment was removed by H2O2and hydrone was removed by dialysis.TAP was identified as polysaccharide through α-naphthol ethanol method and methanol method.The saccharinity of TAP was analyzed through sulphuric acid-phenol method. The results showed that the best extracted technology was in80℃, dosage liquor ratio was1:20,extracted1h and twice.Extracted time was decreased but yield of TAP was increase by hot water extraction combined with20kHz ultrasonic wave. Purified TAP was beige lip lipstick polysaccharide,its yield was6.69%and saccharinity of TAP was92.17%.
2. The influence of TAP on T cellular immune function and immune enhancement mechanism in mouse was observed.The proliferation effect on splenic lymphocyte of mouse was observed through MTT method.The cell factors as IL-4、IL-2and IFN-γ were detected by ELISA;T lymphocyte subgroups were analyzed by flow cytometry (FCM).The expression of above cytokines was detected by RT-PCR.The results showed that,splenic lymphocyte of mouse was activated and proliferated with only TAP,TAP cooperated with ConA or LPS in vitro.Compared with ConA group,25～100μg/mL TAP could significantly promote1L-4、IL-2and IFN-γ secretion of splenocyte in72h (P<0.01),and after treated with25μg/mL TAP in48h,CD4+%(P<0.01) of splenic cell and CD4+/CD8+(P<0.05) were all depressed,but CD8+%(P<0.05)was raised,CD3+%was raised by50μg/mL TAP (P<0.05).IL-4、IL-2and IFN-y mRNA expression were significantly raised by50μg/mL TAP(P<0.01),and they were kept with higher expression level than those of ConA group in72h.TAP could notablely enhance cellular immune function,T lymphocyte was the target cell of TAP.
3. This experiment was conducted to study immunoregulatory effect of TAP and approach to its mechanism in normal and immunosuppressive mouse caused by Cyclophosphamide(CTX).Astragalus polysaccharides(APS)was used as positive control drug.The immunity indices such as macrophage phagocytosis,immune organ indices, serum hemolysin,T lymphocyte subgroup,cell factor,lymphocyte proliferation and immune organ pathological changes were tested.The results showed that20mg/kg TAP could increased hemolysin content (P<0.01),macrophage phagocytosis (P<0.01) and immune organ indices (P<0.01or P<0.05) in nomal and immunosuppressive mouse.Compared with model group,CD4+/CD8+was notably depressed by20mg/kg TAP (P<0.01),the content of IL-2、IFN-γ were respectively increased312.3%(P<0.01) and88.38%(P<0.01),IL-4was apparently degraded (P<0.01) by20mg/kg TAP. Lymphocyte proliferation in vitro was notablely enhanced and immune organ pathological changes were abated by20mg/kg TAP (P<0.01).Compared with APS,TAP had the similar or better immunoregulatory effect. The research provided that the immunosuppression caused by CTX could be antagonized by TAP.The humoral and cellular immunity function were enhanced,and unstuck immune function was corrected by TAP in immunosuppressive mouse.
4. The preparative method,quality control and stability of TAP injection were investigated in the test.TAP injection was prepared through filtration sterilization method in sterile environment.The quality requirements of injection,such as content of tannin,PH, bacteria,pyrogen and microparticle of TAP injection were detected.The content of polysaccharide was detected by sulphuric acid phenol method,and monosaccharide was detected by Fehling's reagent method. The influence of highlight and hyperpyrexia to TAP injection were observed,and the expiration date of TAP injection was estimated through classics constant temperature method.The results showed the detected quality indexes were consistent with requirements of injection,content of polysaccharide was99.2～99.9%, monosaccharide was not discovered in TAP injection,TAP could be degraded by highlight or hyperpyrexia.The stability of TAP injection was better when it was stored away from light in25℃and its expiration date was4.3y.
5. The safety of TAP injection was detected through acute and chronicity toxicity test,local stimulation test,sensitivity test and hemolysis test. Results showed,the LD50of TAP injection in mouse couldn't be detected within162.5～6000mg/kg injected dose.In chronicity toxicity test, paradoxical reaction on physiology or behavior and immune organ pathological changes of mouse didn't be observed within25～100mg/kg injected dose.The TAP injection couldn't cause eye conjunctiva and muscle inflammation,sensitivity or hemolysis reaction.TAP injection could be subcutaneously or intramuscularly injected without side effect.
6. The influence of TAP injection to immunity effect of vaccine was observed in the test.Astragalus polysaccharides (APS) was used as positive control drug.The Foot and Mouth disease (FMD) antibody in piglets were detected by indirect hemagglutination test,and the content of leucocyte (PBL,neutrophil,monocyte and lymphocyte in peripheral blood were detected by animal cytoanalyze.New castle disease (ND) antibody in chicken were detected by hemagglutination inhibition test,and the immune organ indexes were detected.Results showed the antibody of FMD and above blood physiological indexes in piglets were increased during58d after first immuneby high dose TAP injection(P<0.07),its effect gradually weakened after that time.The antibody of ND and immune organ indexes in chicken were increased by middle dose TAP injection (P<0.01).The immune enhancement effect of middle or high dose TAP injection was better than it of APS injection with the same dose.
Above all,TAP was a favourable immunoregulator and had an antagonistic effect to the damage induced by CTX.TAP injection could be subcutaneously or intramuscularly injected with common vaccine,it was safe and effective as a new immunological adjuvant.
1.旨在更经济、安全、高效的分离、纯化TAP,本试验通过对提取温度、料液比、提取时间、提取次数进行单因素试验及正交试验得出最佳热水浸提工艺；通过结合超声波法和热水浸提法提取多糖；以冻融法及Sevage法除蛋白,H202氧化法脱色,透析法等方法纯化多糖；采用α-萘酚乙醇法及甲醇法对多糖进行定性,硫酸苯酚法对多糖进行定量分析。结果表明TAP热水浸提的最佳工艺为80。C、料液比1：20、提取1h,共提取2次；结合20kHz的超声波提取可显著缩短提取时间并提高多糖得率。TAP的纯化物为浅褐色膏状体,定性实验表明所得物质为多糖类物质；鸡枞菌中纯化TAP的提取率为6.69%,纯化TAP的含糖量为92.17%。2.为阐明TAP对T细胞免疫功能的影响及其作用机制,本试验将TAP体外作用小鼠脾淋巴细胞,用MTT法检测TAP对淋巴细胞的增殖作用,ELISA法检测淋巴细胞IL-4、IL-2及IFN-γ分泌量,流式细胞术检测T淋巴细胞亚群,RT-PCR法检测以上细胞因子mRNA表达量。结果表明,TAP可单独以及协同ConA或LPS促进脾淋巴细胞增殖；与ConA组比,25～100μg/mL TAP在作用72h内均能显著促进脾细胞IL-2、 IL-4及IFN-γ的分泌(P<0.01);25μg/mL TAP作用48h后可显著降低被ConA激活的脾细胞中CD4+%(P<0.01)、升高CD8+%(P<0.05),并降低CD4+/CD8+(P<0.05);50μg/mL TAP则可显著升高CD3+%(P<0.01);50μg/mL TAP在作用72h内能显著提高IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表达量(P<0.01),并使其保持较高水平。结果提示,TAP对T细胞免疫功能具有显著增强作用,T淋巴细胞是TAP的靶细胞之一。
3.为了探讨TAP对正常及免疫抑制小鼠免疫功能的影响及其机理,本试验以黄芪多糖(APS)为阳性药物,用环磷酰胺(CTX)制备小鼠免疫抑制模型,检测了不同剂量的TAP对正常小鼠的免疫器官指数、血清溶血素水平、巨噬细胞吞噬功能及对免疫抑制小鼠的以上指标和T淋巴细胞亚群、外周血IL-4、IL-2及IFN-γ,脾淋巴细胞增殖、免疫器官组织病理学变化等免疫指标的影响。结果表明,20mg/kgTAP可显著提高正常及免疫抑制小鼠的溶血素(P<0.01)、免疫器官指数(P<0.01或P<0.05)及巨噬细胞吞噬功能(P<0.01)；与模型组相比,20mg/kgTAP还可降低免疫抑制小鼠的CD4+/CD8+比值(P<0.01),并使外周血IL-2、IFN-γ水平分别上升312.3%(P<0.01)和88.38%(P<0.01),使IL-4水平降低40.30%(P<0.01),可在体外显著促进淋巴细胞增殖(P<0.01),减轻CTX引起的免疫器官病变。TAP与相同剂量的APS相比具有相当或更显著的免疫调节作用。结果显示,TAP能明显拮抗环磷酰胺对小鼠免疫功能的抑制作用,提高小鼠体液及细胞免疫功能,促进紊乱的免疫功能恢复平衡。
4.为了探讨TAP注射液的制备方法、质量控制及其稳定性,本试验在无菌条件下通过过滤除菌法制备TAP注射液,并按照注射剂的相关质量要求对其进行鞣质、PH值、无菌、热原及澄明度的检测；以硫酸苯酚法测定其多糖含量,费林试剂法测定单糖含量；另检测了强光及高热对TAP注射液的影响,通过经典恒温法初步估算TAP注射液的有效期。结果表明,TAP注射液的以上质量控制指标均符合注射剂的基本要求；其多糖含量为标示量的99.2-99.9%,未检测出含有单糖；强光和高温均能引起TAP出现不同程度的降解；TAP注射液在25℃避光下保存其稳定性较好,有效期为4.3年。
5.为了保证TAP注射液在临床使用的安全性,对其进行了急性、亚慢性毒性试验,局部刺激,过敏及溶血试验。结果表明,在急性毒性试验中TAP注射液在对小鼠162.5～6000mg/Kg体重的剂量范围内不能测出其半数致死量LD50；在亚慢性毒性试验中,25～100mg/kg TAP均未引起小鼠生理及行为异常和免疫器官病变；TAP注射液对眼结膜和肌肉无刺激性,不引起过敏和溶血反应。TAP注射液可以用于皮下或肌肉注射给药,无毒副作用。
6.为探讨TAP注射液对疫苗免疫效果的影响,以黄芪多糖(APS)注射液为阳性对照,通过间接血凝试验检测仔猪的口蹄疫抗体水平,用动物血细胞分析仪对免疫仔猪外周血白细胞总数,中性、单核细胞及淋巴细胞数进行了检测；同时又通过血凝抑制试验对新城疫弱毒苗免疫雏鸡的抗体水平及免疫器官指数进行了检测。结果表明,在口蹄疫疫苗首免后58d内,高剂量TAP能显著提高仔猪口蹄疫抗体水平和以上血液生理指标(P<0.01),此后随着时间延长这种作用逐渐减弱；在新城疫疫苗首免后35d内,中剂量TAP可显著提高雏鸡新城疫抗体水平并促进雏鸡免疫器官发育(P<0.01)。中高剂量TAP的免疫增强效果优于相同剂量的APS。
综上所述,TAP是一种良好的免疫增强剂,可以拮抗环磷酰胺对机体的毒副作用；TAP注射液安全有效,在临床上可通过皮下或肌肉注射与常规疫苗配合使用以增强其免疫效果,TAP有望成为一种新型免疫佐剂。
Termitomyces albuminosus (Berk.) Heim. is a kind of famous domestic fungus in Liangshan province in Sichuan. It is liked by many people for its abundance nutritional ingredient and delicious. The extraction,purification and biologic activity of Termitomyces albuminosus polysaccharide(TAP) have been reported a little at home and abroad, and there are no reports on animal health care products or immunologic adjuvant of TAP. In this dissertation,immunological regulation effect and mechanism in vitro or vivo of TAP were researched,and injection of TAP was prepared, it would provide evidence for clinical application as a immunologic adjuvant. The details are divided into six parts as follows:
1.To isolate and purify TAP with an economical,safe and efficient process,we chosed the best hot water diffusion technology through single factor test on extraction temperature, dosage liquor ratio,extraction time and frequency.The protein in TAP was removed by freeze thawing and Sevage method,pigment was removed by H2O2and hydrone was removed by dialysis.TAP was identified as polysaccharide through α-naphthol ethanol method and methanol method.The saccharinity of TAP was analyzed through sulphuric acid-phenol method. The results showed that the best extracted technology was in80℃, dosage liquor ratio was1:20,extracted1h and twice.Extracted time was decreased but yield of TAP was increase by hot water extraction combined with20kHz ultrasonic wave. Purified TAP was beige lip lipstick polysaccharide,its yield was6.69%and saccharinity of TAP was92.17%.
2. The influence of TAP on T cellular immune function and immune enhancement mechanism in mouse was observed.The proliferation effect on splenic lymphocyte of mouse was observed through MTT method.The cell factors as IL-4、IL-2and IFN-γ were detected by ELISA;T lymphocyte subgroups were analyzed by flow cytometry (FCM).The expression of above cytokines was detected by RT-PCR.The results showed that,splenic lymphocyte of mouse was activated and proliferated with only TAP,TAP cooperated with ConA or LPS in vitro.Compared with ConA group,25～100μg/mL TAP could significantly promote1L-4、IL-2and IFN-γ secretion of splenocyte in72h (P<0.01),and after treated with25μg/mL TAP in48h,CD4+%(P<0.01) of splenic cell and CD4+/CD8+(P<0.05) were all depressed,but CD8+%(P<0.05)was raised,CD3+%was raised by50μg/mL TAP (P<0.05).IL-4、IL-2and IFN-y mRNA expression were significantly raised by50μg/mL TAP(P<0.01),and they were kept with higher expression level than those of ConA group in72h.TAP could notablely enhance cellular immune function,T lymphocyte was the target cell of TAP.
3. This experiment was conducted to study immunoregulatory effect of TAP and approach to its mechanism in normal and immunosuppressive mouse caused by Cyclophosphamide(CTX).Astragalus polysaccharides(APS)was used as positive control drug.The immunity indices such as macrophage phagocytosis,immune organ indices, serum hemolysin,T lymphocyte subgroup,cell factor,lymphocyte proliferation and immune organ pathological changes were tested.The results showed that20mg/kg TAP could increased hemolysin content (P<0.01),macrophage phagocytosis (P<0.01) and immune organ indices (P<0.01or P<0.05) in nomal and immunosuppressive mouse.Compared with model group,CD4+/CD8+was notably depressed by20mg/kg TAP (P<0.01),the content of IL-2、IFN-γ were respectively increased312.3%(P<0.01) and88.38%(P<0.01),IL-4was apparently degraded (P<0.01) by20mg/kg TAP. Lymphocyte proliferation in vitro was notablely enhanced and immune organ pathological changes were abated by20mg/kg TAP (P<0.01).Compared with APS,TAP had the similar or better immunoregulatory effect. The research provided that the immunosuppression caused by CTX could be antagonized by TAP.The humoral and cellular immunity function were enhanced,and unstuck immune function was corrected by TAP in immunosuppressive mouse.
4. The preparative method,quality control and stability of TAP injection were investigated in the test.TAP injection was prepared through filtration sterilization method in sterile environment.The quality requirements of injection,such as content of tannin,PH, bacteria,pyrogen and microparticle of TAP injection were detected.The content of polysaccharide was detected by sulphuric acid phenol method,and monosaccharide was detected by Fehling's reagent method. The influence of highlight and hyperpyrexia to TAP injection were observed,and the expiration date of TAP injection was estimated through classics constant temperature method.The results showed the detected quality indexes were consistent with requirements of injection,content of polysaccharide was99.2～99.9%, monosaccharide was not discovered in TAP injection,TAP could be degraded by highlight or hyperpyrexia.The stability of TAP injection was better when it was stored away from light in25℃and its expiration date was4.3y.
5. The safety of TAP injection was detected through acute and chronicity toxicity test,local stimulation test,sensitivity test and hemolysis test. Results showed,the LD50of TAP injection in mouse couldn't be detected within162.5～6000mg/kg injected dose.In chronicity toxicity test, paradoxical reaction on physiology or behavior and immune organ pathological changes of mouse didn't be observed within25～100mg/kg injected dose.The TAP injection couldn't cause eye conjunctiva and muscle inflammation,sensitivity or hemolysis reaction.TAP injection could be subcutaneously or intramuscularly injected without side effect.
6. The influence of TAP injection to immunity effect of vaccine was observed in the test.Astragalus polysaccharides (APS) was used as positive control drug.The Foot and Mouth disease (FMD) antibody in piglets were detected by indirect hemagglutination test,and the content of leucocyte (PBL,neutrophil,monocyte and lymphocyte in peripheral blood were detected by animal cytoanalyze.New castle disease (ND) antibody in chicken were detected by hemagglutination inhibition test,and the immune organ indexes were detected.Results showed the antibody of FMD and above blood physiological indexes in piglets were increased during58d after first immuneby high dose TAP injection(P<0.07),its effect gradually weakened after that time.The antibody of ND and immune organ indexes in chicken were increased by middle dose TAP injection (P<0.01).The immune enhancement effect of middle or high dose TAP injection was better than it of APS injection with the same dose.
Above all,TAP was a favourable immunoregulator and had an antagonistic effect to the damage induced by CTX.TAP injection could be subcutaneously or intramuscularly injected with common vaccine,it was safe and effective as a new immunological adjuvant.
引文
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