单侧输尿管梗阻后大鼠肾脏诱导型一氧化氮合酶的表达及其意义
|
摘要
前言
尿路梗阻性病变在泌尿外科疾病中占有很重要的地位。泌尿系统的很多疾病在其发展过程中均可能出现尿路梗阻问题，如泌尿系统结石、肿瘤、结核和损伤等。引起尿路梗阻的原因很多，病变部位也不同，但最终均可出现肾积水及肾功能受损。根据Bell(1946)的一组统计，59064例尸检中，肾积水占3.1％，尤其近几年随着人口逐步老龄化，其发病率更有逐年增高的趋势。因此进一步认识本病的发病机制，掌握有效的治疗方法，延缓疾病进展的措施己越来越受到高度重视。研究尿路梗阻后肾脏变化的常用模型为单侧输尿管梗阻(UUO)模型，目前，国内对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在UUO大鼠肾脏的表达情况研究很少。本研究旨在观察iNOS在UUO大鼠肾脏的表达及意义。
材料与方法一、研究对象1．实验动物 雄性健康Sprague-Dawley大鼠(由浙江省医学科学院动物中
浙江大学硕士学位论文一中文摘要
心提供）36只，体重25D士20克。
2．动物模型及分组 制备左侧输尿管梗阻模型组（UUO组，30只），分术后
4小时，12小时，24小时，3天和 7天 5个处死组各 6只，同时设假手
术组＊组，6只）作为对照组。动物模型参考国外 HoChber／大鼠以乙
醚吸入麻醉，腹部正中切日，双重结扎左侧输尿管，缝合腹壁。假手术
组未结扎左侧输尿管，其他操作同前。所有动物均给予常规饮食和饮水。
分别于术后 4小时，12小时，24小时，3天和 7天处死大鼠，取出梗阻
肾脏。部分肾组织用液氮保存，后转入一86OC冰箱保存；其余以10％中性
甲醛固定，制成石蜡切片，以备兔疫组化和常规染色用。
二、盯－KR检测：
1．引物序列：GAPDH上游引物为：5’－TGG TGA AGG TCG GTG TGA AC－3’，
下游引物为：5’－GGT GGT GAA GAC GCC AGT AG－3’，扩增长度为 305hP。
iNOS上游引物为；5’－GGA GGA GCT GAT GGA GTA GTA GCG G－3”下游
引物为：5’－叮AnT从CKG％A肛A“‘1 “O3’．扩增长度为
442hP。
2．实验方法：将50mg一100mg冻存组织在液氮中碾磨成粉末，加入lml
TAIZOI试剂提取组织总RNA。取RNA 3fig用于逆转录，PCR反应条
件为：94度预变性4min，然后32个循环的扩增，最后72度延伸10min．
每个循环包括94度变性455，57度退火455，72度延伸605。PCR产物经
1．5％琼脂糖电泳，通过凝胶成像系统读取目的电泳条带的密度扫描值，
将iNOS条带与GAPDH条带的比值作为iNOS的表达相对量。
三、兔疫组化检测
l．免疫组化法检测 iNOS在术侧肾脏中的表达：采用ENVISION（两步法），
iNOS多克隆抗体（抗体稀释比 1：100门7 C 60min；加入 HRP标记的羊抗
鼠 IgG（Envisio 二抗），37OC目 育 60min； DAB显色。
2
浙江大学硕土学位论文一中文摘要
2免疫组化阳性结果判定标准：标准参考国内刘少青口］。阳性细胞为呈棕色
的阳性反应产物。在400倍光镜下观察，随机选5个视野，计数阳性细胞
数和总细胞数，计算出阳性细胞率，然后计分，无阳性细胞为阴性门分入
阳性细胞率在25％以下为弱阳性（2分），25％－50％为阳性（4分），50％以
上为强阳性（6分）。
四、统计学方法
数据以平均数士标准差（二士S）表示，均数间结果比较用方差分析。所
有资料均在SAS6．12软件下操作。HO．05定为统计学差异有显著性
结果
1，肾脏病理改变
肾脏的大体改变：UUO组梗阻侧肾脏重量增加，并出现不同程度肾
盏和肾盂扩张，随着梗阻时间的延长，扩张程度也明显。光镜改变：UUO
组梗阻侧肾脏的肾单位表现为集合管管腔贯张，上皮萎缩，越接近肾盂
侧（远侧肾小管）越明显，近曲小管改变轻微，而肾小球保持正常结构。
在炎细胞浸润方面，UUO组的梗阻侧肾脏与假手术组相比，UUO术后4h
梗阻侧肾脏未见明显的病理变化，id后见小血管周围有少量的炎细胞浸
润，第3d时炎细胞浸润增多，在血管及部分肾小管周围均可见较多的炎
细胞浸润。第7d时炎细胞浸润增多并达到高峰，以单核巨噬细胞为主。
2．各组大鼠肾组织iNOSmRNA表达水平
经RT－PCR扩增后的川OS为442hP，内参照GAPDH为305hP。RT－PCR
的结果显示：与假手术组大鼠比较，单侧输尿管梗阻后仅4h大鼠梗阻侧
肾皮质中即可见iNOS的mRNA表达轻度增强，于第24h明显增强，第3d
达到高峰，以后大鼠梗阻侧肾皮质中iNOS的mRNA表达逐渐减弱，于第
7d 时最低。分析各组iNOS 与GAPDH 光密度比值发现，UUO术后
3
浙江大学硕士学位论文一中文摘要
4h，12h，24h，3d各组大鼠的光密度比值明显高于假手术组（HO二01），梗
阻第7d大鼠梗阻侧肾皮质iNOS的mRNA表达与假手术组大鼠肾脏比较，
其?
Objective
Urinary tract obstruction is a disease process that may result from a diversity of congenital or acquired conditions,ranging from caculi to strictures and to inflammatory processes and malignances.The incidence of hydronephrosis was found in a great autopsy series to be 3.1% among 59064 patients in age from birth to 80 years,with its true incidence is considerably higher,as many of the causes resolve over time or are successfully treated.We attempted to observe the renal expression of inducible nitric oxide synthase(iNOS)in rats with unilateral ureteral obstruction(UUO).
Materials and Methods
Male Sprague-Dawley rats were used throughout the study.UUO was achieved by ligation of the distal left ureter and maintained for either 4
hours(group 1),12 hours(group 2),24 hours(group 3),3 days(group4),or 7 days(group 5).Control rats underwent sham operation without ligating the ureter. Expression of iNOS mRNA were examined in the obstructed kidneys by semi-quantitative RT-PCR. Expression of iNOS protein were examined by immunohistochemistry(two step Envision method). The morphological changes of the obstructed kidneys were also observed .
Results
The gene expression and the protein level of iNOS were begun to increase at 4-hour,were up to peak at 3-day after UUO operation.A few numbers of infiltrating inflammatory cells were found at 24-hour,a large numbers of
infiltrating inflammatory cells were found at 3-day,and the peak of the numbers of those cells was at 7-day after UUO operation.
Conclusions
iNOS is involved in the pathogenesis of the injuries of UUO. iNC 3 may play a protective role in the injuries of UUO.
尿路梗阻性病变在泌尿外科疾病中占有很重要的地位。泌尿系统的很多疾病在其发展过程中均可能出现尿路梗阻问题，如泌尿系统结石、肿瘤、结核和损伤等。引起尿路梗阻的原因很多，病变部位也不同，但最终均可出现肾积水及肾功能受损。根据Bell(1946)的一组统计，59064例尸检中，肾积水占3.1％，尤其近几年随着人口逐步老龄化，其发病率更有逐年增高的趋势。因此进一步认识本病的发病机制，掌握有效的治疗方法，延缓疾病进展的措施己越来越受到高度重视。研究尿路梗阻后肾脏变化的常用模型为单侧输尿管梗阻(UUO)模型，目前，国内对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在UUO大鼠肾脏的表达情况研究很少。本研究旨在观察iNOS在UUO大鼠肾脏的表达及意义。
材料与方法一、研究对象1．实验动物 雄性健康Sprague-Dawley大鼠(由浙江省医学科学院动物中
浙江大学硕士学位论文一中文摘要
心提供）36只，体重25D士20克。
2．动物模型及分组 制备左侧输尿管梗阻模型组（UUO组，30只），分术后
4小时，12小时，24小时，3天和 7天 5个处死组各 6只，同时设假手
术组＊组，6只）作为对照组。动物模型参考国外 HoChber／大鼠以乙
醚吸入麻醉，腹部正中切日，双重结扎左侧输尿管，缝合腹壁。假手术
组未结扎左侧输尿管，其他操作同前。所有动物均给予常规饮食和饮水。
分别于术后 4小时，12小时，24小时，3天和 7天处死大鼠，取出梗阻
肾脏。部分肾组织用液氮保存，后转入一86OC冰箱保存；其余以10％中性
甲醛固定，制成石蜡切片，以备兔疫组化和常规染色用。
二、盯－KR检测：
1．引物序列：GAPDH上游引物为：5’－TGG TGA AGG TCG GTG TGA AC－3’，
下游引物为：5’－GGT GGT GAA GAC GCC AGT AG－3’，扩增长度为 305hP。
iNOS上游引物为；5’－GGA GGA GCT GAT GGA GTA GTA GCG G－3”下游
引物为：5’－叮AnT从CKG％A肛A“‘1 “O3’．扩增长度为
442hP。
2．实验方法：将50mg一100mg冻存组织在液氮中碾磨成粉末，加入lml
TAIZOI试剂提取组织总RNA。取RNA 3fig用于逆转录，PCR反应条
件为：94度预变性4min，然后32个循环的扩增，最后72度延伸10min．
每个循环包括94度变性455，57度退火455，72度延伸605。PCR产物经
1．5％琼脂糖电泳，通过凝胶成像系统读取目的电泳条带的密度扫描值，
将iNOS条带与GAPDH条带的比值作为iNOS的表达相对量。
三、兔疫组化检测
l．免疫组化法检测 iNOS在术侧肾脏中的表达：采用ENVISION（两步法），
iNOS多克隆抗体（抗体稀释比 1：100门7 C 60min；加入 HRP标记的羊抗
鼠 IgG（Envisio 二抗），37OC目 育 60min； DAB显色。
2
浙江大学硕土学位论文一中文摘要
2免疫组化阳性结果判定标准：标准参考国内刘少青口］。阳性细胞为呈棕色
的阳性反应产物。在400倍光镜下观察，随机选5个视野，计数阳性细胞
数和总细胞数，计算出阳性细胞率，然后计分，无阳性细胞为阴性门分入
阳性细胞率在25％以下为弱阳性（2分），25％－50％为阳性（4分），50％以
上为强阳性（6分）。
四、统计学方法
数据以平均数士标准差（二士S）表示，均数间结果比较用方差分析。所
有资料均在SAS6．12软件下操作。HO．05定为统计学差异有显著性
结果
1，肾脏病理改变
肾脏的大体改变：UUO组梗阻侧肾脏重量增加，并出现不同程度肾
盏和肾盂扩张，随着梗阻时间的延长，扩张程度也明显。光镜改变：UUO
组梗阻侧肾脏的肾单位表现为集合管管腔贯张，上皮萎缩，越接近肾盂
侧（远侧肾小管）越明显，近曲小管改变轻微，而肾小球保持正常结构。
在炎细胞浸润方面，UUO组的梗阻侧肾脏与假手术组相比，UUO术后4h
梗阻侧肾脏未见明显的病理变化，id后见小血管周围有少量的炎细胞浸
润，第3d时炎细胞浸润增多，在血管及部分肾小管周围均可见较多的炎
细胞浸润。第7d时炎细胞浸润增多并达到高峰，以单核巨噬细胞为主。
2．各组大鼠肾组织iNOSmRNA表达水平
经RT－PCR扩增后的川OS为442hP，内参照GAPDH为305hP。RT－PCR
的结果显示：与假手术组大鼠比较，单侧输尿管梗阻后仅4h大鼠梗阻侧
肾皮质中即可见iNOS的mRNA表达轻度增强，于第24h明显增强，第3d
达到高峰，以后大鼠梗阻侧肾皮质中iNOS的mRNA表达逐渐减弱，于第
7d 时最低。分析各组iNOS 与GAPDH 光密度比值发现，UUO术后
3
浙江大学硕士学位论文一中文摘要
4h，12h，24h，3d各组大鼠的光密度比值明显高于假手术组（HO二01），梗
阻第7d大鼠梗阻侧肾皮质iNOS的mRNA表达与假手术组大鼠肾脏比较，
其?
Objective
Urinary tract obstruction is a disease process that may result from a diversity of congenital or acquired conditions,ranging from caculi to strictures and to inflammatory processes and malignances.The incidence of hydronephrosis was found in a great autopsy series to be 3.1% among 59064 patients in age from birth to 80 years,with its true incidence is considerably higher,as many of the causes resolve over time or are successfully treated.We attempted to observe the renal expression of inducible nitric oxide synthase(iNOS)in rats with unilateral ureteral obstruction(UUO).
Materials and Methods
Male Sprague-Dawley rats were used throughout the study.UUO was achieved by ligation of the distal left ureter and maintained for either 4
hours(group 1),12 hours(group 2),24 hours(group 3),3 days(group4),or 7 days(group 5).Control rats underwent sham operation without ligating the ureter. Expression of iNOS mRNA were examined in the obstructed kidneys by semi-quantitative RT-PCR. Expression of iNOS protein were examined by immunohistochemistry(two step Envision method). The morphological changes of the obstructed kidneys were also observed .
Results
The gene expression and the protein level of iNOS were begun to increase at 4-hour,were up to peak at 3-day after UUO operation.A few numbers of infiltrating inflammatory cells were found at 24-hour,a large numbers of
infiltrating inflammatory cells were found at 3-day,and the peak of the numbers of those cells was at 7-day after UUO operation.
Conclusions
iNOS is involved in the pathogenesis of the injuries of UUO. iNC 3 may play a protective role in the injuries of UUO.
引文
1. Walsh P C, Retik A B, Vaughan E D, et al. Campbell's Urology, 7th Edtion. Harcourt Publishers Limited, 1998.343
2. Miyajima A, Chen J, Poppas D P, et al. Role of nitric oxide in renal tubular apoptosis of unilateral ureteral obstruction. Kidney Int, 2001,59(4):1290-1303
3．刘少青，姜佑三，严博泉，等。一氧化氮合酶在缺血预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤保护中的应用。中国危重病急救医学，2000，12(4)：211-213
4. Hegarty N J, Young L S, Kirwan C N, et al. Nitric oxide in unilateral obstruction:Effect on regional renal blood flow. Kidney Int, 2001,59(3):1059-1065
5. Morrissey J J, Ishidoya S, McCracken R, et al. Nitric oxide generation ameliorates the tubulointerstitial fibrosis of obstructive nephropathy. J Am Soc Nephrol, 1996,7:2202-2212
6. Hochberg D, Johnson C W, Chen J, et al. Interstitial fibrosis of unilateral obstruction is exacerbated in kidney of mice lacking the gene for inducible nitric oxide synthase. Lab Ivest, 2000,80(1):1721-1728
7.Sawczuk I S, Hoke G, Olsson C A, et al. Gene expression in response to acute unilateral ureteral obstruction. Kidney Int, 1989,35:1315-1319
8.Truong L D, Petrusevska G, Yang G, et al. Cell apoptosis and proliferation in experimental chronic obstructive uropathy. Kidney Int, 1996,50:200-207
2. Miyajima A, Chen J, Poppas D P, et al. Role of nitric oxide in renal tubular apoptosis of unilateral ureteral obstruction. Kidney Int, 2001,59(4):1290-1303
3．刘少青，姜佑三，严博泉，等。一氧化氮合酶在缺血预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤保护中的应用。中国危重病急救医学，2000，12(4)：211-213
4. Hegarty N J, Young L S, Kirwan C N, et al. Nitric oxide in unilateral obstruction:Effect on regional renal blood flow. Kidney Int, 2001,59(3):1059-1065
5. Morrissey J J, Ishidoya S, McCracken R, et al. Nitric oxide generation ameliorates the tubulointerstitial fibrosis of obstructive nephropathy. J Am Soc Nephrol, 1996,7:2202-2212
6. Hochberg D, Johnson C W, Chen J, et al. Interstitial fibrosis of unilateral obstruction is exacerbated in kidney of mice lacking the gene for inducible nitric oxide synthase. Lab Ivest, 2000,80(1):1721-1728
7.Sawczuk I S, Hoke G, Olsson C A, et al. Gene expression in response to acute unilateral ureteral obstruction. Kidney Int, 1989,35:1315-1319
8.Truong L D, Petrusevska G, Yang G, et al. Cell apoptosis and proliferation in experimental chronic obstructive uropathy. Kidney Int, 1996,50:200-207
© 2004-2018 中国地质图书馆版权所有 京ICP备05064691号 京公网安备11010802017129号 地址：北京市海淀区学院路29号 邮编：100083 电话：办公室：(+86 10)66554848；文献借阅、咨询服务、科技查新：66554700 |