铁皮石斛组织培养再生植株及遗传稳定性分析
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摘要
铁皮石斛(Dendrobium candidium Wall.Ex Lindl.)是一种多年生附生兰科(Orchidaceae)植物,是我国传统名贵中药,主要分布于浙江、广西、云南、湖南、贵州等地。铁皮石斛含有多糖、生物碱、氨基酸、微量元素等及一些结构新颖的化合物,具有很高的药用价值和经济价值。本文对铁皮石斛再生体系进行了系统而全面研究,对组培苗和野生苗间采用RPAD分子标记进行分析,以期建立系统的方法,为铁皮石斛药用价值的开发利用提供了重要的科学依据。主要研究结果如下：
1、铁皮石斛再生体系建立
(1)外植体的消毒：根蔸以70%的酒精处理30s,然后用0.2%的升汞灭菌7min效果最佳,无菌外植体得率可达89%；茎段以70%的酒精浸泡20s,然后用0.2%的升汞灭菌3min菌效果最好,无菌外植体得率可达91.1%。
(2)愈伤组织诱导培养：MS+6-BAO.5mg/L+NAAO.1mg/L+2,4-D1.Omg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L,根蔸诱导率93.33%；茎段诱导率95.56%。
(3)增殖培养：MS+6-BA0.5mg/L+IBA1.Omg/L+KT1.Omg/L+Agar7.5g/L愈伤组织生长快,经过30d培养,增殖系数为4.3。
(4)分化培养：1/2MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.Omg/L+香蕉汁50g/L+Agar7.5g/L+蔗糖30g/L,分化率97.78%。
(5)生根培养：1/2MS+NAAO.5mg/L+琼脂7.5g/L+蔗糖30g/L+10%香蕉汁,生根率99%。
(6)炼苗移栽：移栽到1/3腐殖质+1/3苔藓+1/3花生壳的基质中成活率高,为96.9%。
2、再生植株遗传稳定性的RAPD分析
采用RAPD分子标记技术对再生植株与野生植株进行遗传稳定性分析,结果表明：再生植株与野生植株在DNA水平上发生了一定程度变异,其变异百分数为3.33%,同时,组培苗之间也存在这种变异,变异百分数为2.08%。
Dendrobium candidium Wall. Ex Lindl refers to a types of orchid perennial epiphytes, is one of the well known traditional Chinese medicines. Most of Dendrobium candidium Wall. Ex Lindl distribute in the following five major areas of China:ZheJiang,YunNan,HuNan and GuiZhou.According to the current researches,it contains dendrobium polysaccharide, alkaloids, amino acids, trace elements and some novel compounds,with higher medicinal and economic value.In this paper, a systematic and comprehensive study has been did for the whole regeneration system of Dendrobium candidium Wall though tissue culture,the analysis of RAPD polymorphism between seed-derived seedling and regenerated plant. These researches provide a significant scientific basis for the development and utilization of the medicinal value of Dendrobium candidium Wall. Ex Lindl.The main results obtained from the experiment as follows:
1. The system for regeneration of Dendrobium candidium Wall. Ex Lindl
(1)It was disinfected with70%ethanol to30s, brushing with sterile water2times, then treated with0.2%HgCl2for7min,brushing with sterile water5times,the ratio of survival was89%for Root hills;It was disinfected with70%ethanol to20s, brushing with sterile water2times, then treated with0.2%HgCl2for3min,brushing with sterile water5times,the ratio of survival was89%for Stem.
(2)The best callus induction medium:MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+2,4-D1.0mg/L+Sucrose30g/L+Agar7.5g/L, root hills induction rate reached93.33%; Stem induction rate reached95.56%.
(3)The best proliferation medium:MS+6-BA0.5mg/L+IBA1.0mg/L+KT1.0mg/L+Agar7.5g/L, the callus grew fast, the proliferation coefficient reached4.3after30d cultivation.
(4)The best differentiation medium:1/2MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L+banana juice50g/L+Agar7.5g/L+Sucrose30g/L, the differentiation rate reached97.78%.
(5) The best rooting induction medium:1/2MS+NAA0.5mg/L+Agar7.5g/L+Sucrose30g/L+10%banana juice, the rooting rate reached99%.
(6)The better basal material was humus soil:moss:peanut shel1(1:1:1) and the rate of survival was96.9%.
2. The results of RAPD analysis
RAPD molecular markers was used to analy the genetic stability between regenerated plant and wild seedling.The results show that the regenerated plant and wild seedling,compared to the DNA level on acertain extent the percentage variation for3.33%,At the same time that also exists between the regenerated plants,the percent variation for2.08%.
1、铁皮石斛再生体系建立
(1)外植体的消毒：根蔸以70%的酒精处理30s,然后用0.2%的升汞灭菌7min效果最佳,无菌外植体得率可达89%；茎段以70%的酒精浸泡20s,然后用0.2%的升汞灭菌3min菌效果最好,无菌外植体得率可达91.1%。
(2)愈伤组织诱导培养：MS+6-BAO.5mg/L+NAAO.1mg/L+2,4-D1.Omg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L,根蔸诱导率93.33%；茎段诱导率95.56%。
(3)增殖培养：MS+6-BA0.5mg/L+IBA1.Omg/L+KT1.Omg/L+Agar7.5g/L愈伤组织生长快,经过30d培养,增殖系数为4.3。
(4)分化培养：1/2MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.Omg/L+香蕉汁50g/L+Agar7.5g/L+蔗糖30g/L,分化率97.78%。
(5)生根培养：1/2MS+NAAO.5mg/L+琼脂7.5g/L+蔗糖30g/L+10%香蕉汁,生根率99%。
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Dendrobium candidium Wall. Ex Lindl refers to a types of orchid perennial epiphytes, is one of the well known traditional Chinese medicines. Most of Dendrobium candidium Wall. Ex Lindl distribute in the following five major areas of China:ZheJiang,YunNan,HuNan and GuiZhou.According to the current researches,it contains dendrobium polysaccharide, alkaloids, amino acids, trace elements and some novel compounds,with higher medicinal and economic value.In this paper, a systematic and comprehensive study has been did for the whole regeneration system of Dendrobium candidium Wall though tissue culture,the analysis of RAPD polymorphism between seed-derived seedling and regenerated plant. These researches provide a significant scientific basis for the development and utilization of the medicinal value of Dendrobium candidium Wall. Ex Lindl.The main results obtained from the experiment as follows:
1. The system for regeneration of Dendrobium candidium Wall. Ex Lindl
(1)It was disinfected with70%ethanol to30s, brushing with sterile water2times, then treated with0.2%HgCl2for7min,brushing with sterile water5times,the ratio of survival was89%for Root hills;It was disinfected with70%ethanol to20s, brushing with sterile water2times, then treated with0.2%HgCl2for3min,brushing with sterile water5times,the ratio of survival was89%for Stem.
(2)The best callus induction medium:MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+2,4-D1.0mg/L+Sucrose30g/L+Agar7.5g/L, root hills induction rate reached93.33%; Stem induction rate reached95.56%.
(3)The best proliferation medium:MS+6-BA0.5mg/L+IBA1.0mg/L+KT1.0mg/L+Agar7.5g/L, the callus grew fast, the proliferation coefficient reached4.3after30d cultivation.
(4)The best differentiation medium:1/2MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L+banana juice50g/L+Agar7.5g/L+Sucrose30g/L, the differentiation rate reached97.78%.
(5) The best rooting induction medium:1/2MS+NAA0.5mg/L+Agar7.5g/L+Sucrose30g/L+10%banana juice, the rooting rate reached99%.
(6)The better basal material was humus soil:moss:peanut shel1(1:1:1) and the rate of survival was96.9%.
2. The results of RAPD analysis
RAPD molecular markers was used to analy the genetic stability between regenerated plant and wild seedling.The results show that the regenerated plant and wild seedling,compared to the DNA level on acertain extent the percentage variation for3.33%,At the same time that also exists between the regenerated plants,the percent variation for2.08%.
引文
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