耐高温α-淀粉酶基因的克隆、表达及突变
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摘要
本论文研究了出发菌株地衣芽孢杆菌的生理及遗传特性，对它所产的耐高温α-淀粉酶的酶学性质作了初步分析。提取地衣芽孢杆菌的染色体DNA，设计合适引物，运用PCR法扩增得到了耐高温α-淀粉酶基因，并将其克隆在大肠杆菌中。运用重组PCR技术对耐高温α-淀粉酶基因进行定点突变。主要研究以下内容：
1．地衣芽孢杆菌020401所产耐高温α-淀粉酶的主要性质为：最适pH为6.5左右，最适作用温度为85℃，但在95℃时也能保持较高活性。
2．提取地衣芽孢杆菌020401的染色体DNA，设计引物，通过PCR扩增得到了1.9kb的基因片段。将其克隆在pUC19质粒上，并转化Escherichia coli JM109，运用蓝白选择及透明圈法筛选到了一株阳性克隆JM109／pUAM。
3．通过酶活测定及蛋白电泳分析证明JM109／pUAM菌株能分泌外源基因的表达产物即耐高温α-淀粉酶，目的蛋白大小约为60000左右。
4．对此基因片段进行测序，并将测序结果同已发表的地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因序列进行比对，同源性高达99％以上。
5．将该基因克隆在表达型载体pGEM-3Zf(+)上并转化E．coliJM109，同样得到了一株能产耐高温α-淀粉酶的阳性克隆JM109／pGAM，SDS-PAGE电泳证明其产生的目的蛋白大小同JM109／pUAM菌株大小相同，酶活测定表明菌株JM109／pGAM分泌目的蛋白的能力比JM109／pUAM强。
6．运用重组PCR技术对目的基因编码第134位氨基酸残基和第320位氨基酸残基的密码子分别进行了突变，将突变后的两种基因分别克隆在pGEM-3Zf(+)质粒上，转化E．coli JM109，通过蓝白选择及透明圈法筛选到了两株阳性克隆菌株JM109／pGAT1和JM109／pGAT2。
The physiological and genetic characteristics of Bacillus licheniformis 020401 were studied, and the enzymic character of the heat-stable α-amylase produced by this strain was analyzed. The heat-stable α-amylase gene was amplified from B. licheniformis with PCR and cloned in Escherichia coli. The gene was mutated by recombinant PCR. The mainly researching contents were showed as below:
1. The optimum pH and temperature of the heat-stable a-amylase produced by B. licheniformis 020401 was 6.5 and 85℃, separately, thought it could remain superior activity at 95℃.
2. The chromosome DNA of B. lichenformis 020401 was extracted., The gene of 1.9kb was obtained by PCR with appropriate primers. The
gene was then connected with pUC19 plasmid and the recombinant plasmid was transformed into E. coli JM109. A positive clone JM109/pUAM was screened by the blue-white choose and halo method.
3. It was proved that the JM109/pUAM could secret heat-stable α-amylase into the medium through measuring the activity of the a-amylase in the cell-free supernatant of the culture. The relative molecular weight of the a-amylase was about 60000 by SDS-PAGE.
4. The sequence of the gene was menstruated and compared with the known sequence of the heat-stable a-amylase gene. The homology was above 99%.
5. The aim gene was connected with pGEM-3Zf(+) plasmid and cloned into E. coli JM109, and as a result, a positive clone JM109/pGAM was obtained. It had the same protein producing ability as JM109/pUAM and the activity of the a-amylase was higher than that of the JM109/pUAM.
6. The codes of the a-amylase gene were mutated at the amino acid 134 and 320, respectively. The two kinds of gene were separately connected with pGEM-3Zf(+) plasmid and transformed into E. coli JM109. Two positive clones, JM109/pGATl and JM109/pGAT2, were obtained.
1．地衣芽孢杆菌020401所产耐高温α-淀粉酶的主要性质为：最适pH为6.5左右，最适作用温度为85℃，但在95℃时也能保持较高活性。
2．提取地衣芽孢杆菌020401的染色体DNA，设计引物，通过PCR扩增得到了1.9kb的基因片段。将其克隆在pUC19质粒上，并转化Escherichia coli JM109，运用蓝白选择及透明圈法筛选到了一株阳性克隆JM109／pUAM。
3．通过酶活测定及蛋白电泳分析证明JM109／pUAM菌株能分泌外源基因的表达产物即耐高温α-淀粉酶，目的蛋白大小约为60000左右。
4．对此基因片段进行测序，并将测序结果同已发表的地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因序列进行比对，同源性高达99％以上。
5．将该基因克隆在表达型载体pGEM-3Zf(+)上并转化E．coliJM109，同样得到了一株能产耐高温α-淀粉酶的阳性克隆JM109／pGAM，SDS-PAGE电泳证明其产生的目的蛋白大小同JM109／pUAM菌株大小相同，酶活测定表明菌株JM109／pGAM分泌目的蛋白的能力比JM109／pUAM强。
6．运用重组PCR技术对目的基因编码第134位氨基酸残基和第320位氨基酸残基的密码子分别进行了突变，将突变后的两种基因分别克隆在pGEM-3Zf(+)质粒上，转化E．coli JM109，通过蓝白选择及透明圈法筛选到了两株阳性克隆菌株JM109／pGAT1和JM109／pGAT2。
The physiological and genetic characteristics of Bacillus licheniformis 020401 were studied, and the enzymic character of the heat-stable α-amylase produced by this strain was analyzed. The heat-stable α-amylase gene was amplified from B. licheniformis with PCR and cloned in Escherichia coli. The gene was mutated by recombinant PCR. The mainly researching contents were showed as below:
1. The optimum pH and temperature of the heat-stable a-amylase produced by B. licheniformis 020401 was 6.5 and 85℃, separately, thought it could remain superior activity at 95℃.
2. The chromosome DNA of B. lichenformis 020401 was extracted., The gene of 1.9kb was obtained by PCR with appropriate primers. The
gene was then connected with pUC19 plasmid and the recombinant plasmid was transformed into E. coli JM109. A positive clone JM109/pUAM was screened by the blue-white choose and halo method.
3. It was proved that the JM109/pUAM could secret heat-stable α-amylase into the medium through measuring the activity of the a-amylase in the cell-free supernatant of the culture. The relative molecular weight of the a-amylase was about 60000 by SDS-PAGE.
4. The sequence of the gene was menstruated and compared with the known sequence of the heat-stable a-amylase gene. The homology was above 99%.
5. The aim gene was connected with pGEM-3Zf(+) plasmid and cloned into E. coli JM109, and as a result, a positive clone JM109/pGAM was obtained. It had the same protein producing ability as JM109/pUAM and the activity of the a-amylase was higher than that of the JM109/pUAM.
6. The codes of the a-amylase gene were mutated at the amino acid 134 and 320, respectively. The two kinds of gene were separately connected with pGEM-3Zf(+) plasmid and transformed into E. coli JM109. Two positive clones, JM109/pGATl and JM109/pGAT2, were obtained.
引文
[1] 张树政．酶制剂工业．科学出版社．1998
[2] 谷军．α-淀粉酶的生产与应用[J]．生物技术．1994，4(3)：1-5
[3] 陈陶声，胡学智．酶制剂生产技术．化学工业出版社．1994
[4] 江西食品以酵工业科学研究所．酶制剂生产和在食品工业中的应用．轻工业出版社．1977
[5] 白坤，于德贵，周冬颖．α-淀粉酶的性质及其液化作用[J]．中国酿造．1995，5：1-5
[6] 陈陶声．近代工业微生物．上海科学技术出版社．1982
[7] 山田浩一．食品工业微生物．光琳书院．1963
[8] 翁醒华．酶工程与酶制剂．化学工业出版社．1992
[9] 杨俊豪，胡学智．地衣芽孢杆菌A．4041耐高温α-淀粉酶的研究[J]．微生物学通报．1990，17(5)：286-289
[10] 胡学智，凌晨，候琴芳等．高温α-淀粉酶生产菌种选育的研究[J]．微生物学报．1991，31(4)：267-273
[11] 任大明，何超刚，钱祖卫等．嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆和表达[J]．生物工程学报．1987，3(3)：197-202
[12] 蒋如璋，耿运琪，倪津等．地衣形芽孢杆菌热稳定α-淀粉酶基因的分子克隆及其在枯草杆菌中的表达[J]．遗传学报．1987，14(5)：323-331
[13] 刘莉，陈炜，金城．芝田硫化叶菌新型α-淀粉酶基因在大肠杆菌的克隆和表达[J]．微生物学报．2000，40(3)：323-326
[14] 史永昶，姜涌明．五种α-淀粉酶测活方法的比较研究[J]．微生物学通报．1996，23(6)：371-373
[15] 王福荣，唐景春．耐高温α-淀粉酶活力测定法的研究[J]．食品与发酵工业．1995，2：27-30
[16] 高崎羲幸．耐酸·耐熟性α-遗伝[P]．特开平8-289788，1996，11
[17] 刘仲敏，曾辉，何新民等．耐高温α-淀粉酶的研制开发及酶学特性的研究[J]．食品工业科技．1999，20(4)：18-20
[18] 马向东，康海霞，黄春华等．枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆及表达[J]．河南农业大学学报。2000，34(4)：223-226
[19] 李冬颖，刘坤，马明等．α-淀粉酶基因在D-核糖生产菌中的表达[J]．南开大学学报(自然科学)．2001，34(1)：1-4
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[29] 姚汝华，赵继伦．酒精发酵工艺学．华南理工大学出版社．1999
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[32] 高群玉，黄立新，黄农荣等．耐高温α-淀粉酶作用于谷物粉液化水解性质的研究[J]．中国粮油学报．2001，16(6)：1-4
[33] 王博彦，金其荣．发酵有机酸生产与应用手册[J]．中国轻工业出版社．2000
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[37] 王凯军，秦人伟．发酵工业废水处理．科学工业出版社
[38] 张丽苹，徐岩，金建中．酸性α-淀粉酶的研究与应用[J]．酿酒．2002，29(3)：19-22
[39] 刘春莉，张文学，杨瑞．新型耐酸性α-淀粉酶液态发酵条件的研究[J] ．四川大学学报(工程科学版)．2003，35(1)：63—65
[40] Jutta Matzke, Birgit Sehwermann, Evert P. Bakker. Acidostable and aeidophilic proteins: the example of the or-amylase from Alicyclobacillus acidocaldarius[J]. Comp. Bioehem. Physiol. 1997, 118A(3): 475-479
[41] 今中忠行等．超耐热性酸性α-该α-产生遗
伝子含DNA断片[P]．特开平9-173077，1997，7
[42] 周德庆．微生物学教程．高等教育出版社．1995
[43] 张丽苹，徐岩．酸性α-淀粉酶生产菌株的选育的初步研究[J]．工业微生物．2002，32(4)：11-14
[44] 中华人民共和国行业标准QB-1997，耐高温α-淀粉酶制剂
[45] 冯仁丰．实用医学检验手册．上海科学技术出版社．2000
[46] J．萨姆布鲁，E．F弗里奇，T．曼尼阿蒂斯(金冬雁，黎孟枫，侯云德，等译)．分子克隆实验指南(第三版)．科学出版社，2002
[47] 乔建军，杜连祥．一种快速有效的枯草芽孢杆菌染色体的提取方法[J] ．生物技术．2001，11(2)：38-40
[48] 董莹．聚合酶链反应改良技术及其用途[J]．中国寄生虫病防治杂志．2001，14(1)：61-63
[49] 吴乃虎．基因工程原理．科学出版社．2001
[50] 汪家政，范明．蛋白质技术手册．科学出版社．2002
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