鹿茸口服液制备及其对小鼠免疫作用的研究
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摘要
目的:采用传统常规中药提取方法浸渍法和回流法提取鹿茸有效生物成分,以粗提液中有效物质浸出量为参考进行提取方法的优化筛选;以壳聚糖为澄清剂,制备鹿茸口服液,检测口服液中氨基酸的含量,参照药典中口服液各项指标,初步建立鹿茸口服液的质量标准;同时建立动物模型,观察鹿茸口服液在动物临床试验中的免疫作用。
方法:(1)水醇结合为溶媒,采用浸渍和回流提取法对鹿茸中有效成分进行充分提取,以时间、溶媒倍数、浓缩比例为影响因素,有效浸出物为评价依据进行方法的优化筛选;茚三酮、双缩脲反应和薄层层析定性检测提取液中蛋白质、甘氨酸,采用考马斯亮蓝G250法测定鹿茸几种提取液样品中粗蛋白含量,并绘制蛋白质含量标准曲线。(2)使用澄清剂吸附法除杂,常规方法制备鹿茸口服液,按照国家药典2005年版合剂标准检测各项指标,试剂盒检测口服液中蛋白质含量,应用氨基酸自动分析仪对口服液氨基酸含量进行分析,并与粗提液中各项水解氨基酸含量进行比较,以此为鹿茸口服液质控标准提供依据。(3)用环磷酰胺复制免疫抑制小鼠模型(50mg/kg),测定脾脏重量和腹腔巨噬细胞吞噬功能,比色法测定血清溶血素(HC50),MTT法检测植物血凝素(PHA)和脂多糖(LPS)分别诱导的脾脏T、B淋巴细胞转化功能,从而研究鹿茸口服液对小鼠免疫功能的影响。
结果:(1)根据蛋白质含量标准曲线测得两种提取方法提取的粗蛋白含量分别为浸渍法:42.85μg/mL、41.16μg/mL;回流法:57.21μg/mL、16.94μg/mL。据此得出结论,回流提取方法具有反复提取性,鹿茸粗提物含量较高,但花费时间较长,消耗溶媒量较大;就本试验研究方法而论,以75%乙醇作为溶媒,回流提取法所得粗提液有效物质较高。(2)采用口服液常规制备方法、壳聚糖絮凝法改善澄清度制备而成的鹿茸口服液澄清度、稳定性良好,质量控制检测符合2005年国家药典合剂各项标准;采用氨基酸自动分析仪分析总氨基酸含量为15.63mg/100mL换算为提取液同比浓度后,氨基酸总含量为293.063mg/mL,与提取液含量47.2mg/100mL比较差异显著(p<0.05)。(3)鹿茸口服液能够增强正常小鼠体液免疫功能,并能大幅度恢复免疫抑制小鼠的体液免疫水平,在一定剂量上能够提高小鼠细胞免疫功能,免疫抑制组小鼠灌服高剂量鹿茸口服液能够增加脾指数(p<0.05),灌服0.1mL鹿茸口服液则明显提高了正常小鼠脾指数(p<0.01)。灌服鹿茸口服液对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力没有明显作用。
小结:提取优化结果以75%乙醇作为溶媒,回流法提取的有效物质中粗蛋白含量较高为57.21μg/mL;按照国家药典口服液制备方法制备鹿茸口服液,采用壳聚糖絮凝法改善澄清度,参照2005年国家药典合剂各项标准初步建立鹿茸口服液质量标准,制备而成的鹿茸口服液具有稳定性、澄清度良好,存放期间无变质,有少量沉淀,符合合剂的各项指标;鹿茸口服液能够提高正常小鼠机体免疫功能;能够恢复免疫力低下模型小鼠的体液免疫和细胞免疫功能;对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能没有明显作用。
Objective: Use conventional Chinese crude drug extraction methods as technique of impregnation extraction and recirculation extraction to extract biological components of pilose antler. Extraction methods were optimized with biological components of crude extract as the standard. Chitosan as clarificant, Preparation of pilose antler oral liquid, detection amino acid content of oral solution.Reference misture index in pharmacopoeia and then establish the quality standard for pilose antler oral liquid. Meamwhile, establish model of hypoimmunit in mice for observe effect of pilose antler oral solution in animal clinical test.
Method: (1) Water and alcohol as dissolvent, we used technique of impregnation extraction and recirculation extraction to extract biological components from pilose antler. Optimize extraction methods according to components of crude extract as standard at different time, dissolvent volume and different concentration proportion. Protein was detected by ninhydrin reaction, biuret reaction and TLC. We determined content of protein with Brodford from several crude extract, and draw standard curve of protein content. (2) We used enzyme hydrolyzing and flocculating method cleaning dopant. Pilose antler oral liquid was prepared by conventional method, and determined content of protein by Coomassie brilliant blue kit. To analyse amino acid components of oral liquid so as to provide basis for the quality standard for pilose antler oral liquid by amino acid analyzer. (3)The models of mice on the hypoimmunity were induced by CTX. The weight of spleen and the function of abdominal cavity macrophage were measured. Spectrophotography was used to estimate levels of serum hemolysin antibody. The proliferation of T and B lymphocytes were observed by MTT assay, so as to investigate the effect of POAL on immunological function in mice.
Result: (1) We calculated components of crude protein in two extraction methods on the basis of standard curve of protein content. The components of crude protein are 42.85μg/mL and 41.16μg/mL with technique of impregnation extraction, and 57.21μg/mL and 16.94μg/mL with recirculation extraction. We conclude the technique of recirculation extraction could be repeated and the level of crude extract is relative high. But this method takes more time and expend large bulk of solvent .In present study, the technique of recirculation get more crude extract use 75% alcohol for dissolvent. (2)We adopt conventional method of preparation, enzyme hydrolyzing and flocculating method to improve clarity. And the pilose antler oral liquid has good clarity and good stability. The quality consistent with misture standard from States Pharmacopoeia. Besides, we analyze total amino acid contents of oral liquid by amino acid analyzer. The total amino acid contents are 15.63mg/100mL, which is significantly higher than the contents of crude extract liquid 47.2mg/100mL when convert same level with crude extract liquid. (3)The PAOL could enhance the immunological function in normal mice and could significant recovery humoral immunity level of hypoimmunity in mice. In addition, the PAOL could improve cell immunity in mice. The PAOL could enhance the spleen index in immunosuppression mice (p<0.05). The 0.1mL PAOL could enhance the spleen index in normal mice. But the PAOL did not have the effect of improving phagocytosis function of PMΦin mice.
Brief summary: The result of optimize extraction is that there is relative high crude protein level in recirculation extraction of 57.21μg/mL when using 75% alcohol for dissolvent. According to the method of oral liquid offered by States Pharmacopoeia, pilose antler oral liquid was prepared. Using enzyme hydrolyzingand flocculating method improve clarity, we have established quality standard for pilose antler oral liquid according to misture standard of 2005 states Pharmacopoeia. The pilose antler oral liquid was of good clarity and stability. The quality maintains well with little deposition, which indicates that it consistent with misture standard. The PAOL could enhance immunological function, and could recovery humoral immunity function and cell immunity function at the model of hypoimmunity, while it has not improved phagocytosis function of PMΦin mice.
方法:(1)水醇结合为溶媒,采用浸渍和回流提取法对鹿茸中有效成分进行充分提取,以时间、溶媒倍数、浓缩比例为影响因素,有效浸出物为评价依据进行方法的优化筛选;茚三酮、双缩脲反应和薄层层析定性检测提取液中蛋白质、甘氨酸,采用考马斯亮蓝G250法测定鹿茸几种提取液样品中粗蛋白含量,并绘制蛋白质含量标准曲线。(2)使用澄清剂吸附法除杂,常规方法制备鹿茸口服液,按照国家药典2005年版合剂标准检测各项指标,试剂盒检测口服液中蛋白质含量,应用氨基酸自动分析仪对口服液氨基酸含量进行分析,并与粗提液中各项水解氨基酸含量进行比较,以此为鹿茸口服液质控标准提供依据。(3)用环磷酰胺复制免疫抑制小鼠模型(50mg/kg),测定脾脏重量和腹腔巨噬细胞吞噬功能,比色法测定血清溶血素(HC50),MTT法检测植物血凝素(PHA)和脂多糖(LPS)分别诱导的脾脏T、B淋巴细胞转化功能,从而研究鹿茸口服液对小鼠免疫功能的影响。
结果:(1)根据蛋白质含量标准曲线测得两种提取方法提取的粗蛋白含量分别为浸渍法:42.85μg/mL、41.16μg/mL;回流法:57.21μg/mL、16.94μg/mL。据此得出结论,回流提取方法具有反复提取性,鹿茸粗提物含量较高,但花费时间较长,消耗溶媒量较大;就本试验研究方法而论,以75%乙醇作为溶媒,回流提取法所得粗提液有效物质较高。(2)采用口服液常规制备方法、壳聚糖絮凝法改善澄清度制备而成的鹿茸口服液澄清度、稳定性良好,质量控制检测符合2005年国家药典合剂各项标准;采用氨基酸自动分析仪分析总氨基酸含量为15.63mg/100mL换算为提取液同比浓度后,氨基酸总含量为293.063mg/mL,与提取液含量47.2mg/100mL比较差异显著(p<0.05)。(3)鹿茸口服液能够增强正常小鼠体液免疫功能,并能大幅度恢复免疫抑制小鼠的体液免疫水平,在一定剂量上能够提高小鼠细胞免疫功能,免疫抑制组小鼠灌服高剂量鹿茸口服液能够增加脾指数(p<0.05),灌服0.1mL鹿茸口服液则明显提高了正常小鼠脾指数(p<0.01)。灌服鹿茸口服液对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力没有明显作用。
小结:提取优化结果以75%乙醇作为溶媒,回流法提取的有效物质中粗蛋白含量较高为57.21μg/mL;按照国家药典口服液制备方法制备鹿茸口服液,采用壳聚糖絮凝法改善澄清度,参照2005年国家药典合剂各项标准初步建立鹿茸口服液质量标准,制备而成的鹿茸口服液具有稳定性、澄清度良好,存放期间无变质,有少量沉淀,符合合剂的各项指标;鹿茸口服液能够提高正常小鼠机体免疫功能;能够恢复免疫力低下模型小鼠的体液免疫和细胞免疫功能;对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能没有明显作用。
Objective: Use conventional Chinese crude drug extraction methods as technique of impregnation extraction and recirculation extraction to extract biological components of pilose antler. Extraction methods were optimized with biological components of crude extract as the standard. Chitosan as clarificant, Preparation of pilose antler oral liquid, detection amino acid content of oral solution.Reference misture index in pharmacopoeia and then establish the quality standard for pilose antler oral liquid. Meamwhile, establish model of hypoimmunit in mice for observe effect of pilose antler oral solution in animal clinical test.
Method: (1) Water and alcohol as dissolvent, we used technique of impregnation extraction and recirculation extraction to extract biological components from pilose antler. Optimize extraction methods according to components of crude extract as standard at different time, dissolvent volume and different concentration proportion. Protein was detected by ninhydrin reaction, biuret reaction and TLC. We determined content of protein with Brodford from several crude extract, and draw standard curve of protein content. (2) We used enzyme hydrolyzing and flocculating method cleaning dopant. Pilose antler oral liquid was prepared by conventional method, and determined content of protein by Coomassie brilliant blue kit. To analyse amino acid components of oral liquid so as to provide basis for the quality standard for pilose antler oral liquid by amino acid analyzer. (3)The models of mice on the hypoimmunity were induced by CTX. The weight of spleen and the function of abdominal cavity macrophage were measured. Spectrophotography was used to estimate levels of serum hemolysin antibody. The proliferation of T and B lymphocytes were observed by MTT assay, so as to investigate the effect of POAL on immunological function in mice.
Result: (1) We calculated components of crude protein in two extraction methods on the basis of standard curve of protein content. The components of crude protein are 42.85μg/mL and 41.16μg/mL with technique of impregnation extraction, and 57.21μg/mL and 16.94μg/mL with recirculation extraction. We conclude the technique of recirculation extraction could be repeated and the level of crude extract is relative high. But this method takes more time and expend large bulk of solvent .In present study, the technique of recirculation get more crude extract use 75% alcohol for dissolvent. (2)We adopt conventional method of preparation, enzyme hydrolyzing and flocculating method to improve clarity. And the pilose antler oral liquid has good clarity and good stability. The quality consistent with misture standard from States Pharmacopoeia. Besides, we analyze total amino acid contents of oral liquid by amino acid analyzer. The total amino acid contents are 15.63mg/100mL, which is significantly higher than the contents of crude extract liquid 47.2mg/100mL when convert same level with crude extract liquid. (3)The PAOL could enhance the immunological function in normal mice and could significant recovery humoral immunity level of hypoimmunity in mice. In addition, the PAOL could improve cell immunity in mice. The PAOL could enhance the spleen index in immunosuppression mice (p<0.05). The 0.1mL PAOL could enhance the spleen index in normal mice. But the PAOL did not have the effect of improving phagocytosis function of PMΦin mice.
Brief summary: The result of optimize extraction is that there is relative high crude protein level in recirculation extraction of 57.21μg/mL when using 75% alcohol for dissolvent. According to the method of oral liquid offered by States Pharmacopoeia, pilose antler oral liquid was prepared. Using enzyme hydrolyzingand flocculating method improve clarity, we have established quality standard for pilose antler oral liquid according to misture standard of 2005 states Pharmacopoeia. The pilose antler oral liquid was of good clarity and stability. The quality maintains well with little deposition, which indicates that it consistent with misture standard. The PAOL could enhance immunological function, and could recovery humoral immunity function and cell immunity function at the model of hypoimmunity, while it has not improved phagocytosis function of PMΦin mice.
引文
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