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白芷香豆素类成分与分泌组织的相关性研究
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摘要
加强中药基础学科的研究是提高我国中药产业原始创新能力的重要途径,是中药研发实现重大突破的必要条件。白芷为四十种大宗常用中药材品种之一,市场需求量大。同许多道地药材一样,虽近年来研究报道颇多,但有关其活性成分的生物来源机制研究,特别是相关植物学基础研究较为薄弱,有待开展及深入。前期研究已初步发现白芷的活性成分香豆素与其分泌组织密切相关,但迄今为止,有关研究报道极少。本文通过科学、系统的实验研究,阐明两者的具体关系,为进一步阐释白芷香豆素类成分的生物来源机制奠定扎实的植物解剖学基础,对揭示白芷药材品质和产量形成的关键因素具有重要作用;同时,作为基础研究,其结果对进一步推进白芷药材的鉴定、品种选育、规范化栽培技术等相关研究、获得原始创新均具有积极意义。
     本文以植物组织、细胞水平为切入点,积极引入结构植物学、组织化学等现代生物学先进技术透射电子显微镜技术(TEM)、激光共聚焦显微镜技术(SLCM)等,结合中药学研究方法,紧紧围绕白芷活性成分香豆素类与其分泌组织的关系这一核心内容开展了以下研究工作:
     1.白芷不同营养器官分泌组织结构及分布的比较解剖研究
     首次开展白芷不同营养器官分泌组织结构及分布的比较解剖学研究。研究结果表明:白芷根、茎、叶中均分布有分泌组织,集中在药用部位根的韧皮部中及茎、叶的维管束周围;不同营养器官中的分泌组织其结构基本一致。重点开展了白芷药用部位根中分泌组织的解剖学研究,掌握了其分布、结构和类型:栓内层散在分布分泌腔;韧皮部中密集分布分泌道,且呈现径向放射状排列。
     2.白芷根分泌道的超微结构研究
     通过研究,确定了白芷根分泌道的超薄切片制备技术;并运用TEM技术观察白芷根中分泌道的超微结构,揭示了其超微结构特征。白芷根中分泌道上皮细胞的细胞质中质体、内质网、核糖体、线粒体、高尔基体数目较多,但质体很少观察到内膜结构,线粒体嵴不发达,内质网、核糖体均分布在上皮细胞靠近腔组织细胞壁一侧的细胞质中;而周围相邻薄壁细胞中的质体发育良好,具有复杂的内膜结构并积累淀粉。
     3.白芷根中香豆素类成分的组织化学研究
     通过白芷根冰冻切片主要影响因素保护剂、包埋剂、切片厚度及切片方法的考查,结合植物冰冻切片的基本制作步骤,首次确定白芷根冰冻切片的最佳制备方法;并运用冰冻切片和荧光显微镜技术,首次通过实验发现白芷根中香豆素类成分仅分布于分泌组织中;同时,引入SLCM技术进行了白芷根中香豆素类成分的相对定量探索研究。
     4.白芷根分泌道密度系数与欧前胡素含量的关系研究
     参考有关研究报道,结合白芷根分泌组织解剖学特征,首次提出白芷根韧皮部分泌道密度系数的测算方法,其测算公式为:分泌道密度系数=皮部比例(%)×分泌道密度(个/mm2)×分泌道面积(近似为圆形,μm2);并运用其开展了白芷根分泌道密度系数与欧前胡素含量的相关性分析。结果表明:白芷根分泌道密度系数与欧前胡素含量成正相关关系,即分泌道密度系数愈大,其欧前胡素含量愈高。
     本研究引入结构植物学、组织化学等植物学研究方法,结合药用植物学、中药鉴定学、中药化学等中药学研究方法,将中药活性成分与植物内部结构联系起来,从中药化学成分的生物来源角度研究中药,学科结合,优势互补,方法创新,为开拓出学科交叉的新研究领域,拓展中药的研究提供了一定的参考。
Strengthening basic research on Chinese medicinal materials is the important way to improve the ability of original innovation in TCM industry. And it is the sufficient and necessary condition to achieve key breakthroughs in TCM research and development. Angelica dahurica radix is one of the40commonly used Chinese medicinal materials. Same as many other authentic medicinal materials, although there are many research reports about Angelica dahurica radix in recent years,but hardly any study on biological source mechanism of the active ingredients, especially relevant botany basic research. We previously showed that the coumarin was closely related to secretory tissues in Angelica dahurica.But up to now,there are few reports on the relationship.So the further scientific and systematic research is needed.The relationship between the coumarin and secretory tissues in Angelica dahurica will be systematically explained for the first time. This thesis will lay a strong base for the future research on biological source mechanism of the coumarin.The result will have an important role in revealing the key factors about medicine quality and yield of Angelica dahurica radix. At the same time, as the basic research, the results of this project has a positive meaning for the further studies on Angelica dahurica radix for achieving original innovation.
     Based on the previous studies, we studied the relationship between the coumarin and secretory tissues in Angelica dahurica radix at plant tissue and cellular level by introducing advanced technologies of structure botany and histochemistry, such as transmission electron microscopy(TEM), laser scanning confocal microscopy(LSCM). The main research work is as follows:
     1. Comparative anatomical study on structure and distribution of secretory tissues in different nutritive organs of Anglica dahurica
     The study results show that there are secretory tissues which the structure are similar in root,stem,leaf of Anglica dahurica. And the secretory tissues are most frequently located in the phloem of root which is the medical part of Anglica dahurica and located around the vascular bundles of stem and leaf. This paper mainly researches the anatomical characteristics of secretory tissues in root from distribution, structure and type. The results show that secretion cavitites are scattered in the inner bolt and secretion canals are higher abundance distributed with a racial, radial pattern in the phloem.
     2. Study on ultrastructure of the secretory canals in the root of Anglica dahurica
     A feasible preparation method of ultrathin slicing of Anglica dahurica root was finded out. The ultrastructure features of the secretory canals in the root of Anglica dahurica was observed and revealed by TEM.The electron microscope observations suggest that secretory cells in the Anglica dahurica root contain many plasids,endoplasmic reticulum, ribosomes, mitochondria and Golgi complexes,but much smaller plastids have lining structure. The quantity of mitochondrial crista are not affluence. In epithelial cells endoplasmic reticulum and ribosomes distribut in the the cytoplasm near the side of the seretory cavity.But the plastids in parenchyma have complicated lining structure and accumulate starch.
     3. Histochemical study of coumarin in the root of Anglica dahurica
     In this experiments a optimal cryo-section method in the root of Anglica dahurica is selected for the first time. The histochemical allocation of the coumarin in the root of the Anglica dahurica was studied by using the fluorescent microscopy. The results show that the coumarin, which releases blue fluorescence under the fluorescent microscopy, exists in secretary tissues. Meantime,relative content of coumarins in roots of Anglica dahurica were studied by using LSCM.
     4. Study on the relationship between the secretory canals index and the imperatorin contents in the root of Anglica dahurica
     Relevance was analyzed between secretory canals index and imperatorin contents by using the method which is putted forward the measuring and calculating method of secretory canals index for the first time in this thesis. The result shows that there is a linear relationship between coumarins contents and secretory canals index on root in Anglica dahurica. Bigger the secretory canals index, higher the imperatorin contents.
     This thesis study Chinese medicinal material from biological source mech anism of the medical composition by using research methods of Chinese medicin e and botany, such as structure botany, histochemistry,medical botany, TCM identify,TCM chemistry.To study Chinese medicinal material by relating medical compositions and the structure of plant, to make the advantages of relevant departments complementary with each other, and to provide reference f or development of the TCM research.
引文
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