玻璃微珠载体的制备与固定化酶条件的研究
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摘要
本研究首先用分相法和填充法制作了两种多孔玻璃微珠FXBL和TCBL，用它们作为载体分别用物理吸附法、共价偶联法和重氮法固定了α－淀粉酶，在对它们的固定效果比较后，选取了共价偶联法进行了较详细的研究；确定了共价偶联α－淀粉酶的最佳固定条件、最佳应用条件和固定化酶的性质；并研究了多孔玻璃微珠制作条件对固定化酶的影响和多孔玻璃微珠对过氧化氢酶及谷氨酸脱羧酶的固定化效果，主要结果如下：
(1)FXBL和TCBL的平均粒径分别为1．48mm和1．49mm：FXBL的侵蚀率为33．65％；FXBL和TCBL均有较好的强度，分别为32Kg／Cm~2和26Kg／Cm~2；FXBL和TCBL的吸水率分别是27．37％和25．32％；体积密度分别是1．34g／Cm~3和1．37g／Cm~3；显气孔率分别是33．60％和31．87％。
(2)用γ－氨丙基三乙氧基硅烷处理微珠表面最佳时间为3h，活化烷基胺玻璃微珠TCBL和FXBL时戊二醛的最佳浓度分别为3％和2％
(3)共价偶联法固定α－淀粉酶的最佳固定条件为：温度10℃；pH=6．2；给酶量TCBL为2．6g／L、FXBL为2．4g／L；时间12h。
(4)共价偶联法固定α－淀粉酶的最佳应用条件为：温度75℃，TCBL固定化酶pH值为5．2、FXBL固定化酶为5．4，分别比自由酶的最适pH 6．0低0．8和0．6个pH单位。
(5)固定化α－淀粉酶的性质：在80℃受热1h，固定化酶的活力下降小于7％，而自由酶活力则下降至63％；FXBL固定化酶和TCBL固定化酶分别使用5次和8次还可以保持60％的活力。
(6)用TCBL作载体的固定化酶的总活力为357．39U／g，固定化活力回收率为39．79％，活力表现率为66．73％。用FXBL作载体的固定化酶的总活力为324．96U／g，固定化活力回收率为36．18％，活力表现率为54．25％。
(7)580℃分相玻璃优于560℃，分相时间到36h后，分相对固定化酶活力影响不大；多孔玻璃用0．3 mol／L的KOH溶液扩孔3h是最理想；当盐酸的浓度为0．3mol／L时侵蚀成孔，固定化α－淀粉酶活力达到最大值。
(8)多孔玻璃固定酶有一定通用性，主要取决于其表面的改性情况，本实验的表面实际为戊二醛，所以能被戊二醛交联的酶，就可用本载体制备固定化酶。
To begin with, two kinds of porous glass beads, FXBL and TCBL, were prepared by phase separation and stuffing salts. The beads were used as carrier for immobilizingα-amylase by aborption, convalent binding and diazotization-coupling methods. And meanwhile, the three methods were compared through effect of immobilization, so one of them, the convalent binding method, was picked out and studied in detail, then the optimal conditions of the immobilization and application are obtained. After then, the properties of immobilization ofα-amylase were studied . Secondly , effect of making porous glass bead process on immobilizedα-amylase was studied . Finally, porous glass beads were used as carrier for immobilizing catalase and glutamic acid decarboxylase, so the effectiveness of porous glass beads as carrier was verified. The main conclusion is followed as:
(1) The mean diameter of FXBL is 1.48mm and TCBL is 1.49mm. Erosion Ratio of FXBL is 33.65%. In terms of FXBL and TCBL, Strength is 32 kg /cm~2 and 26kg /cm~2, and Water Absorption is 27.37% and 25.32%, and Bulk Density is 1.34 g/cm~3 and 1.37 g/cm~3, and Apparent Porosity is 33.60% and 31.87%.
(2)It is 3h that the optimal bead surfaces treatment time byγ-aminopropyl triethoxy silane. It is 3% that the optimal concentration of glutaraldehyde which activates alkylamine glass beads TCBL's surface , so is 2% to FXBL.
(3)The optimal conditions of the immobilization ofα-amylase , by convalent binding, is as followed: temperature is 10℃, pH is 6.2, the load of enzyme is 2. 6g/L(to TCBL) and 2. 4g/L(to FXBL) , time is 12h.
(4)the optimal application conditions of theα-amylase that immobilized by convalent binding is as followed: temperature is 75℃, and temperature being 5℃higher than the freeα-amylase , pH is 5.2 (to TCBL )and 5.4 (to FXBL), and pH value reducing 0.6 (to TCBL) and 0.8 (to FXBL)unit than the freeα-amylase.
(5)Fundamental properties of immobilizedα-amylase is as followed: If treating 1h at 80℃, the activity of immobilizedα-amylase would decline less than 7%, and the activity of freeα-amylase would be reduced to 63%, obviously, the thermal stability of immobiliziedα-amylase is excellent than freeα-amylase. After immobilized α-amylase is reused 5 (to FXBL) and 8 (to TCBL ) times , their activities can been kept about 60% .
(6)Under the optimal immobilizing conditions, immobilizedα-amylase was obtained, and under the optimal applying conditions, the activity of immobiliziiedα-amylase was detected, and experimental results were as follows: the immobilizedα-amylase on TCBL has a total activity 357. 39U/g, a recovery rate 39. 79%, and an expression activity 66.73%. Similarly, they are 324.96U/g, 36.18%, 54. 25% on FXBL
(7)Phase Separation at 580°C get the grab on 560℃, after 36h, the time of Phase Separation has little effect on activity of immobilizedα-amylase. Hole reamed by 0.3 mol/L potassium hydroxide solution is the most effective. After hole is eroded by 0. 3 mol/L hydrochloric acid solution , immobilizedα-amylase has the maximum activity.
(8)Generality of porous glass as carrier is dependent on the state which their surfaces are. modified.
(1)FXBL和TCBL的平均粒径分别为1．48mm和1．49mm：FXBL的侵蚀率为33．65％；FXBL和TCBL均有较好的强度，分别为32Kg／Cm~2和26Kg／Cm~2；FXBL和TCBL的吸水率分别是27．37％和25．32％；体积密度分别是1．34g／Cm~3和1．37g／Cm~3；显气孔率分别是33．60％和31．87％。
(2)用γ－氨丙基三乙氧基硅烷处理微珠表面最佳时间为3h，活化烷基胺玻璃微珠TCBL和FXBL时戊二醛的最佳浓度分别为3％和2％
(3)共价偶联法固定α－淀粉酶的最佳固定条件为：温度10℃；pH=6．2；给酶量TCBL为2．6g／L、FXBL为2．4g／L；时间12h。
(4)共价偶联法固定α－淀粉酶的最佳应用条件为：温度75℃，TCBL固定化酶pH值为5．2、FXBL固定化酶为5．4，分别比自由酶的最适pH 6．0低0．8和0．6个pH单位。
(5)固定化α－淀粉酶的性质：在80℃受热1h，固定化酶的活力下降小于7％，而自由酶活力则下降至63％；FXBL固定化酶和TCBL固定化酶分别使用5次和8次还可以保持60％的活力。
(6)用TCBL作载体的固定化酶的总活力为357．39U／g，固定化活力回收率为39．79％，活力表现率为66．73％。用FXBL作载体的固定化酶的总活力为324．96U／g，固定化活力回收率为36．18％，活力表现率为54．25％。
(7)580℃分相玻璃优于560℃，分相时间到36h后，分相对固定化酶活力影响不大；多孔玻璃用0．3 mol／L的KOH溶液扩孔3h是最理想；当盐酸的浓度为0．3mol／L时侵蚀成孔，固定化α－淀粉酶活力达到最大值。
(8)多孔玻璃固定酶有一定通用性，主要取决于其表面的改性情况，本实验的表面实际为戊二醛，所以能被戊二醛交联的酶，就可用本载体制备固定化酶。
To begin with, two kinds of porous glass beads, FXBL and TCBL, were prepared by phase separation and stuffing salts. The beads were used as carrier for immobilizingα-amylase by aborption, convalent binding and diazotization-coupling methods. And meanwhile, the three methods were compared through effect of immobilization, so one of them, the convalent binding method, was picked out and studied in detail, then the optimal conditions of the immobilization and application are obtained. After then, the properties of immobilization ofα-amylase were studied . Secondly , effect of making porous glass bead process on immobilizedα-amylase was studied . Finally, porous glass beads were used as carrier for immobilizing catalase and glutamic acid decarboxylase, so the effectiveness of porous glass beads as carrier was verified. The main conclusion is followed as:
(1) The mean diameter of FXBL is 1.48mm and TCBL is 1.49mm. Erosion Ratio of FXBL is 33.65%. In terms of FXBL and TCBL, Strength is 32 kg /cm~2 and 26kg /cm~2, and Water Absorption is 27.37% and 25.32%, and Bulk Density is 1.34 g/cm~3 and 1.37 g/cm~3, and Apparent Porosity is 33.60% and 31.87%.
(2)It is 3h that the optimal bead surfaces treatment time byγ-aminopropyl triethoxy silane. It is 3% that the optimal concentration of glutaraldehyde which activates alkylamine glass beads TCBL's surface , so is 2% to FXBL.
(3)The optimal conditions of the immobilization ofα-amylase , by convalent binding, is as followed: temperature is 10℃, pH is 6.2, the load of enzyme is 2. 6g/L(to TCBL) and 2. 4g/L(to FXBL) , time is 12h.
(4)the optimal application conditions of theα-amylase that immobilized by convalent binding is as followed: temperature is 75℃, and temperature being 5℃higher than the freeα-amylase , pH is 5.2 (to TCBL )and 5.4 (to FXBL), and pH value reducing 0.6 (to TCBL) and 0.8 (to FXBL)unit than the freeα-amylase.
(5)Fundamental properties of immobilizedα-amylase is as followed: If treating 1h at 80℃, the activity of immobilizedα-amylase would decline less than 7%, and the activity of freeα-amylase would be reduced to 63%, obviously, the thermal stability of immobiliziedα-amylase is excellent than freeα-amylase. After immobilized α-amylase is reused 5 (to FXBL) and 8 (to TCBL ) times , their activities can been kept about 60% .
(6)Under the optimal immobilizing conditions, immobilizedα-amylase was obtained, and under the optimal applying conditions, the activity of immobiliziiedα-amylase was detected, and experimental results were as follows: the immobilizedα-amylase on TCBL has a total activity 357. 39U/g, a recovery rate 39. 79%, and an expression activity 66.73%. Similarly, they are 324.96U/g, 36.18%, 54. 25% on FXBL
(7)Phase Separation at 580°C get the grab on 560℃, after 36h, the time of Phase Separation has little effect on activity of immobilizedα-amylase. Hole reamed by 0.3 mol/L potassium hydroxide solution is the most effective. After hole is eroded by 0. 3 mol/L hydrochloric acid solution , immobilizedα-amylase has the maximum activity.
(8)Generality of porous glass as carrier is dependent on the state which their surfaces are. modified.
引文
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