利用组织培养诱导枣和酸枣多倍体研究
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摘要
本试验以二倍体冬枣(Z．jujuba cv．Dongzao)和酸枣(Ziziphus acidojujuba C．Y．Cheng et M．J．Liu)的二倍体组培苗为试材，以秋水仙碱为诱变剂，在组织培养条件下首次获得了酸枣和冬枣的纯合四倍体植株。并建立了适于枣组培苗组织培养诱变、纯化、鉴定技术体系，同时以二倍体为对照，研究了变异株在形态学、细胞学等方面的变化。此外，还建立了枣和酸枣四倍体组培苗的快繁体系并对聚乙烯醇对组培苗抗玻璃化的作用进行了较为系统的研究。主要研究结果如下：
1 不同诱变材料、不同处理方法对组培苗的诱变效果不同，以丛芽混培最高，依次为茎段浸泡、丛芽浸泡、茎段混培。酸枣和冬枣丛芽的最佳处理时间和浓度的组合均为含50mg／L秋水仙素的MS培养基混培处理40d，诱变频率分别为36.67％和26.67％；酸枣茎段的最佳处理时间和浓度组合为0.4％的秋水仙素溶液处理4d，诱变频率为23.33％；冬枣茎段最佳处理时间和浓度的组合为0.4％的秋水仙素溶液浸泡处理2d，诱变频率为16.67％。相比之下，混培法更适合于丛芽诱变，浸泡法更适于茎段诱变。酸枣的诱变频率明显高于冬枣。
2 不同诱变材料、不同处理方法对组培苗的致死率不同。以茎段浸泡最高，依次为茎段混培、丛芽浸泡、丛芽混培。酸枣茎段在0.6％的秋水仙素溶液中浸泡处理6d，死亡率为66.70％；冬枣茎段为86.70％。酸枣茎段在100mg／L的秋水仙素培养基处理40d，死亡率为为30.00％；冬枣茎段在100mg／L的秋水仙素培养基处理40d，死亡率为为70.00％。相比之下，浸泡法对处理材料的伤害比混培法大，茎段较丛芽更易受到伤害。冬枣对秋水仙素的忍耐力明显低于酸枣。
3 将诱变处理的组培苗的茎段、丛芽进行4d的预培养、15d的暗培养以及在培养基中添加1.0％的二甲基亚砜均可有效提高诱变频率；1.5g／L的活性炭可有效降低处理材料的褐化率。
4 在组织培养条件下，利用切割分离的方法对嵌合体进行纯化。如此进行3-4次分离，对得到的四倍体诱导生根，检测顶芽、侧芽、根尖的染色体倍性，染色体数目均为48条，获得了酸枣和冬枣的纯合四倍体植株。将获得的纯合四倍体在组织培养条件下继代8次后，再次进行顶芽、侧芽、根尖的染色体倍性检测，染色体数目仍均为48条，即纯合四倍体在组织培养条件下得到了稳定。
5 四倍体组培苗与二倍体组培苗相比显著变化为：叶片变大变厚、叶色变深、叶缘锯齿增大、锯齿数目减少，茎粗加粗、叶片气孔密度减小、保卫细胞增大、保卫细胞内叶绿体数目增多等多倍体的一般特征。但叶片呈现出先变圆而后恢复的现象，节间长度也呈现出先变短而后恢复的现象。二、四倍体茎尖和叶片石蜡切片显微结构表
明，四倍体茎尖组织发生层细胞增大;四倍体叶片栅栏组织、海绵组织增厚，疏导组
织发达。
6酸枣四倍体最佳增值培养基和生根培养基激素种类与浓度配比分别为:MS+
BA2.smg/L十IBAO.2一0.6mg/L，增殖系数为3.6;1/2 MS+IBAI.omg/L，生根率为
100%。冬枣四倍体最佳增值培养基和生根培养基分别为:MS+BA3.sm岁L+
IBAo.2一o一6mg几，增殖系数为3.2;l/2 MS+IBA2.omg/L，生根率为100%。
7四倍体组培苗对玻璃化的抗性明显高于二倍体，酸枣对玻璃化的抗性明显高于
冬枣。在培养基中添加2留L的聚乙烯醇，可显著提高正常苗率，酸枣二倍体正常苗
率由57.5%上升到95.0%;酸枣四倍体由80.0%上升到100%。冬枣二倍体和四倍体
正常苗率分别由47.5%和70.0%上升到97.5%和100%。
By treating shoot segments and cluster buds with colchicines, two tetraploid plants of Acid jujube and one tetraploid plant of 'Dongzao' were first obtained by tissue culture . The induction system in vitro was set up. At the same time, with the diploid plants as comparison, the cytological and morphological characters of tetraploid were studied systematically. The simplified course of ploidy identify was selected out. The tetraploid plants propagation and shooting system were studied. The main results are as following:
1 Different materials and methods make the double effect different . The order of doubling effect is mix-culture for cluster buds, soaking for shoot segments, soaking for cluster buds, mix-culture for shoot segments. The optimum compages of concentration and time of colchicines for Acid jujube and 'Dongzao' is MS medium added by 50mg/L colchicines for 40d. The doubling effect is 36.67% and 26.27% separately; The shoot segments of Acid jujube treated by 0.4% colchicines for 4d leaded the highest doubling effect: 23.33%; The shoot segments of 'Dongzao' treated by 0.4% colchicines for 2d leaded the highest doubling effect: 16.67%. Mix-culture is the optimum method for cluster buds induction, soaking is the optimum method for shoot segments induction. In contrast, the doubling ability of Acid jujube is superior to 'Dongzao' .
2 Different materials and methods make the death rate different. The order of death rate is soaking for shoot segments, mix-culture for shoot segments, soaking for cluster buds, mix-culture for cluster buds. The maximum death rate of shoot segments of Acid jujube in soaking by 0.6% colchicines for 6d is 66.70%; The maximum death rate of shoot segments of 'Dongzao' in soaking by 0.6% colchicines for 6d is 86.70%. The maximum death rate of shoot segments of Acid jujube in mix-culture by 100mg/L colchicines in medium for 40d is 30.00%; The maximum death rate of shoot segments of
'Dongzao' in mix-culture by 100mg/L colchicines in medium for 40d is 70.00%; In contrast ,the soaking method does more harm to materials, shoot segments are more harmed than cluster buds, the endureness to colchicines of Acid jujube is superior to
'Dongzao' .
3 Some means can improve the doubling effect of treated materials distinctly. Such as pre- culture for 4d, darkness treatment for 15d ,adding 0.5% DMSO and so on. Adding 1.5mg/L active carbon can decrease the materials browning.
4 By tissue culture, chimeras were purified by incision. The tetraploid partments of chimeras were separated after incision 3~4 times. When propagated and rooted, the ploidy of different apparatus was inspected. The number of chromosome is 48, which indicated the chimera was purified successfully. After propagated 8 times, the ploidy of different apparatus was inspected once again, The number of chromosome is also 48, which indicated the tetraploid was stabled successfully by tissue culture.
5 Comparing with their original diploid plants, the induced tetraploid plants showed that the leaves become longer, wider and thicker. And the serration of the leave become larger than CK, but the serration number per centimeter is less than normal leaves. The leave index and internode length show smaller than CK at the beginning of inducing and recover at the stability. Basing on the stomata density obviously decreased, the guard cells are larger and the chloroplasts in the guard cells are more than the average ones. The microstructure olefin slice of shoot tip and leaves show that the size of cells of diffirent layers of shoot apexy of tetraploid is larger than diploid; The thickness of tetraploid leaves is thicker than diploid; the leading tissue is upgrowther.
6 The optimum multiplication and shooting medium of Acid jujube tetraploid plants are MS with BA2.5mg/L and IBA0.2~0.6mg/L, the propagation is 3.6; 1/2MS with IBA1.0mg/L, the rooting rate is 100%. The optimum multiplication and shooting medium of 'Dongzao' tetraploid plants are MS with BA3.5mg/L and IBA0.2~0.6mg/L, the propagation is 3.2; 1/2MS
1 不同诱变材料、不同处理方法对组培苗的诱变效果不同，以丛芽混培最高，依次为茎段浸泡、丛芽浸泡、茎段混培。酸枣和冬枣丛芽的最佳处理时间和浓度的组合均为含50mg／L秋水仙素的MS培养基混培处理40d，诱变频率分别为36.67％和26.67％；酸枣茎段的最佳处理时间和浓度组合为0.4％的秋水仙素溶液处理4d，诱变频率为23.33％；冬枣茎段最佳处理时间和浓度的组合为0.4％的秋水仙素溶液浸泡处理2d，诱变频率为16.67％。相比之下，混培法更适合于丛芽诱变，浸泡法更适于茎段诱变。酸枣的诱变频率明显高于冬枣。
2 不同诱变材料、不同处理方法对组培苗的致死率不同。以茎段浸泡最高，依次为茎段混培、丛芽浸泡、丛芽混培。酸枣茎段在0.6％的秋水仙素溶液中浸泡处理6d，死亡率为66.70％；冬枣茎段为86.70％。酸枣茎段在100mg／L的秋水仙素培养基处理40d，死亡率为为30.00％；冬枣茎段在100mg／L的秋水仙素培养基处理40d，死亡率为为70.00％。相比之下，浸泡法对处理材料的伤害比混培法大，茎段较丛芽更易受到伤害。冬枣对秋水仙素的忍耐力明显低于酸枣。
3 将诱变处理的组培苗的茎段、丛芽进行4d的预培养、15d的暗培养以及在培养基中添加1.0％的二甲基亚砜均可有效提高诱变频率；1.5g／L的活性炭可有效降低处理材料的褐化率。
4 在组织培养条件下，利用切割分离的方法对嵌合体进行纯化。如此进行3-4次分离，对得到的四倍体诱导生根，检测顶芽、侧芽、根尖的染色体倍性，染色体数目均为48条，获得了酸枣和冬枣的纯合四倍体植株。将获得的纯合四倍体在组织培养条件下继代8次后，再次进行顶芽、侧芽、根尖的染色体倍性检测，染色体数目仍均为48条，即纯合四倍体在组织培养条件下得到了稳定。
5 四倍体组培苗与二倍体组培苗相比显著变化为：叶片变大变厚、叶色变深、叶缘锯齿增大、锯齿数目减少，茎粗加粗、叶片气孔密度减小、保卫细胞增大、保卫细胞内叶绿体数目增多等多倍体的一般特征。但叶片呈现出先变圆而后恢复的现象，节间长度也呈现出先变短而后恢复的现象。二、四倍体茎尖和叶片石蜡切片显微结构表
明，四倍体茎尖组织发生层细胞增大;四倍体叶片栅栏组织、海绵组织增厚，疏导组
织发达。
6酸枣四倍体最佳增值培养基和生根培养基激素种类与浓度配比分别为:MS+
BA2.smg/L十IBAO.2一0.6mg/L，增殖系数为3.6;1/2 MS+IBAI.omg/L，生根率为
100%。冬枣四倍体最佳增值培养基和生根培养基分别为:MS+BA3.sm岁L+
IBAo.2一o一6mg几，增殖系数为3.2;l/2 MS+IBA2.omg/L，生根率为100%。
7四倍体组培苗对玻璃化的抗性明显高于二倍体，酸枣对玻璃化的抗性明显高于
冬枣。在培养基中添加2留L的聚乙烯醇，可显著提高正常苗率，酸枣二倍体正常苗
率由57.5%上升到95.0%;酸枣四倍体由80.0%上升到100%。冬枣二倍体和四倍体
正常苗率分别由47.5%和70.0%上升到97.5%和100%。
By treating shoot segments and cluster buds with colchicines, two tetraploid plants of Acid jujube and one tetraploid plant of 'Dongzao' were first obtained by tissue culture . The induction system in vitro was set up. At the same time, with the diploid plants as comparison, the cytological and morphological characters of tetraploid were studied systematically. The simplified course of ploidy identify was selected out. The tetraploid plants propagation and shooting system were studied. The main results are as following:
1 Different materials and methods make the double effect different . The order of doubling effect is mix-culture for cluster buds, soaking for shoot segments, soaking for cluster buds, mix-culture for shoot segments. The optimum compages of concentration and time of colchicines for Acid jujube and 'Dongzao' is MS medium added by 50mg/L colchicines for 40d. The doubling effect is 36.67% and 26.27% separately; The shoot segments of Acid jujube treated by 0.4% colchicines for 4d leaded the highest doubling effect: 23.33%; The shoot segments of 'Dongzao' treated by 0.4% colchicines for 2d leaded the highest doubling effect: 16.67%. Mix-culture is the optimum method for cluster buds induction, soaking is the optimum method for shoot segments induction. In contrast, the doubling ability of Acid jujube is superior to 'Dongzao' .
2 Different materials and methods make the death rate different. The order of death rate is soaking for shoot segments, mix-culture for shoot segments, soaking for cluster buds, mix-culture for cluster buds. The maximum death rate of shoot segments of Acid jujube in soaking by 0.6% colchicines for 6d is 66.70%; The maximum death rate of shoot segments of 'Dongzao' in soaking by 0.6% colchicines for 6d is 86.70%. The maximum death rate of shoot segments of Acid jujube in mix-culture by 100mg/L colchicines in medium for 40d is 30.00%; The maximum death rate of shoot segments of
'Dongzao' in mix-culture by 100mg/L colchicines in medium for 40d is 70.00%; In contrast ,the soaking method does more harm to materials, shoot segments are more harmed than cluster buds, the endureness to colchicines of Acid jujube is superior to
'Dongzao' .
3 Some means can improve the doubling effect of treated materials distinctly. Such as pre- culture for 4d, darkness treatment for 15d ,adding 0.5% DMSO and so on. Adding 1.5mg/L active carbon can decrease the materials browning.
4 By tissue culture, chimeras were purified by incision. The tetraploid partments of chimeras were separated after incision 3~4 times. When propagated and rooted, the ploidy of different apparatus was inspected. The number of chromosome is 48, which indicated the chimera was purified successfully. After propagated 8 times, the ploidy of different apparatus was inspected once again, The number of chromosome is also 48, which indicated the tetraploid was stabled successfully by tissue culture.
5 Comparing with their original diploid plants, the induced tetraploid plants showed that the leaves become longer, wider and thicker. And the serration of the leave become larger than CK, but the serration number per centimeter is less than normal leaves. The leave index and internode length show smaller than CK at the beginning of inducing and recover at the stability. Basing on the stomata density obviously decreased, the guard cells are larger and the chloroplasts in the guard cells are more than the average ones. The microstructure olefin slice of shoot tip and leaves show that the size of cells of diffirent layers of shoot apexy of tetraploid is larger than diploid; The thickness of tetraploid leaves is thicker than diploid; the leading tissue is upgrowther.
6 The optimum multiplication and shooting medium of Acid jujube tetraploid plants are MS with BA2.5mg/L and IBA0.2~0.6mg/L, the propagation is 3.6; 1/2MS with IBA1.0mg/L, the rooting rate is 100%. The optimum multiplication and shooting medium of 'Dongzao' tetraploid plants are MS with BA3.5mg/L and IBA0.2~0.6mg/L, the propagation is 3.2; 1/2MS
引文
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