中药壁虎质量控制关键技术与质量评价体系研究
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摘要
目的
在传统中医药理论的指导下,结合现代科学技术手段,以中药壁虎为研究对象,通过对收集到的壁虎药材进行系统的本草考证、文献综述、生药学研究、定性定量分析、指纹图谱构建和药效学研究,以期建立动物类中药壁虎的质量控制关键技术和质量评价体系。
主要内容与研究方法
1.本草考证与国内外文献综述——大量查阅历代本草和现代文献,从名称、品种、产地、生境、药用部位、采收加工、炮制、性味归经等方面对中药壁虎进行本草考证,从动物资源、生药学研究、化学成分、药理作用、临床应用等方面对中药壁虎进行国内外文献综述。
2.生药学研究——应用动物分类学知识对收集到的10个产地的壁虎药材进行品种鉴定,并从外部形态、大小、色泽、气味等方面进行药材性状分析,利用粉末显微鉴别技术和有效部位薄层色谱鉴别技术对药材进行生药学鉴定。
3.含量测定研究——通过正交试验优选出壁虎药材蛋白质的提取工艺,利用考马斯亮蓝染色法对不同产地壁虎药材中可溶性总蛋白的含量进行测定；通过正交试验优选壁虎药材多糖的提取工艺,并利用苯酚—硫酸法对不同产地壁虎药材的多糖含量进行测定；测定不同产地壁虎药材的粗脂含量,并采用铝蓝比色法对药材中的磷脂含量进行测定。
4.常规检查项目测定——按照《中国药典》2010年版一部附录规定的方法对不同产地的壁虎药材进行了全面的水分、灰分和浸出物测定分析。
5.指纹图谱研究——利用蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术建立壁虎药材不同部位的蛋白质指纹图谱；利用溴化钾压片法对药材粉末进行红外光谱测定分析；利用紫外谱线组法对药材进行紫外光谱测定分析,建立壁虎药材的紫外谱线指纹图谱；利用高效液相色谱技术优选壁虎药材的HPLC指纹图谱条件,建立壁虎药材的高效液相色谱指纹图谱。
6.药效学研究——提取壁虎药材的多肽和多糖成分,并分别进行体外抗肿瘤实验,用MTT法检测壁虎多肽和多糖成分对人肝癌bel-7402细胞和人乳腺癌MCF-7细胞的杀伤作用。
结果
1.经鉴定本研究应用的壁虎药材均来源于无蹼壁虎(Gekko swinhonis Guenther),不同产地的药材性状及显微特征基本相似,产地间的细微差异可能与壁虎的生活环境、养殖方式、药材加工方法等因素有关。
2.建立了壁虎药材的薄层色谱鉴别方法与检测指标。
3.优选出壁虎药材蛋白提取工艺：pH值为12,料液比为1:20,提取温度为50℃,超声提取时间为80min。不同产地壁虎药材的可溶性蛋白含量有明显差异,因此,蛋白含量可以作为药材质量评价的指标之一。
4.优选出壁虎药材多糖提取工艺：超声提取时间为20min,溶剂量为30倍,醇沉浓度为90%。不同产地壁虎药材的多糖含量有较大差异,因此,多糖含量可以作为药材质量评价的指标之一
5.不同产地壁虎药材的粗脂和总磷脂含量有明显差异,提示药材质量存在差异。
6.根据常规检查项目的测定结果,提出了壁虎药材的水分、灰分和浸出物含量的质量评价参考标准。经实验探讨,确定了壁虎药材醇浸出物测定的乙醇浓度为70%。
7.建立了壁虎药材的红外光谱与紫外谱线组指纹图谱。
8.建立了壁虎药材不同部位的蛋白质指纹图谱。
9.建立了壁虎药材的HPLC指纹图谱,并标定了8个共有特征指纹峰。
10.药效学研究表明,壁虎药材多肽和多糖成分均具有一定的抗肿瘤作用。
11.建立了壁虎药材的质量控制规范(草案),并做出起草说明。
结论
中药壁虎具有较强的抗肿瘤作用,现已广泛应用于临床。该药材未载入《中国药典》,也没有部颁质量标准,目前还未见对其进行相关质量控制与评价的报道。从这个意义上来讲,本研究具有开创性意义,对壁虎药材的现代化研究和开发利用具有很大的促进作用。本课题首次从药材性状、显微鉴定、薄层色谱鉴别、主要成分含量测定、指纹图谱建立、常规项目检查、药效学研究等方面对壁虎药材的质量控制关键技术与评价指标进行了较为系统、全面的研究,建立了壁虎药材的蛋白质指纹图谱、红外和紫外光谱指纹图谱、HPLC指纹图谱,并提出了质量评价标准(草案),为该药材的质量控制与评价奠定了基础。
Objective
Under the guidance of theories of Traditional Chinese Medicine and combining with modern scientific and technological methods, we take Chinese medicine Gekko swinhonis as the research object to establish the key techniques of quality control and evaluation system of animal drug Gekko swinhonis by systematic study of Gekko swinhonis from different habitats from the aspects of herbal textual research, literature review, pharmacognostic studies, qualitative and quantitative analysis, fingerprinting construction and pharmacodynamic study.
Main Research Contents and Methods
1. Herbal textual research and literature review at home and abroad---Herbal textual research on Chinese medicine Gekko swinhonis was done from the aspects of name, variety, habitat, medicinal part, harvest, process and flavor of herbal medicines based on consulting material medica of the past dynasties and modern literatures. At the same time, literatures of Gekko swinhonis at home and abroad were reviewed from the aspects of animal resources, pharmacognostic studies, chemical constituents, pharmacological action and clinical application.
2. Pharmacognostic study---Variety identification was conducted for Gekko swinhonis medicinal materials from10habitats with application of animal taxonomy. And character analysis was conducted from the aspects of external morphology, size, color, smell and so on. Moreover, microscopic identification and TLC were used in pharmacognosy identification of Gekko swinhonis.
3. Components determination---Orthogonal test was employed to optimize the extraction techniques of protein and polysaccharide, and the content of water-soluble protein and polysaccharide of Gekko swinhonis medicinal materials from10habitats were determined using the technology of Coomassie brilliant blue stained and phenol-sulfuric acid method, respectively. Contents of crude fat and total phospholipid were also determined by molybdenum blue colorimetry.
4. Examination items determination---Content of water, ash and extract of Gekko swinhonis from different habitats were determined according to the Chinese Pharmacopoeia in2010.
5. Fingerprint study---Establishing the protein fingerprint of Gekko swinhonis by using polyacrylamide gel electrophoresis. The ultraviolet fingerprint spectrums group draft of Gekko swinhonis were established with the different multi-polar solvent system extract. The infrared spectrum of Gekko swinhonis was established with pressing potassium bromide troche. The chromatographic fingerprint of Gekko swinhonis was established by high performance liquid chromatography.
6. Pharmacodynamic study---Polypeptide and polysaccharide components of Gekko swinhonis medicinal materials were extracted to detect the killing effect of the active extracts on bel-7402(human hepatocellular carcinoma cell line) and MCF-7(human breast cancer cell line) by MTT assay.
Results
1. The medicinal materials in this study are all Gekko swinhonis, the morphological and microscopical characters are similar, and the difference of external morphology maybe due to different living environment, breeding way and processing method, etc.
2. The TLC identification method and detection index of Gekko swinhonis medicinal materials were developed.
3. The optimized extraction technique of protein is:pH12, solid-liquid ratio1'.20and80min for extraction at the temperature of50℃. The content of water-soluble protein of Gekko swinhonis medicinal materials showed obvious difference with habitat, so it can be served as an index of quality evaluation of Gekko swinhonis.
4. The optimized extraction technique of polysaccharide is:20min for extraction, solid-liquid ratio1:30and alcohol concentration of90%. The content of polysaccharide of Gekko swinhonis medicinal materials also showed obvious difference with habitat, so it can be served as another index of quality evaluation of Gekko swinhonis.
5. The content of crude fat and total phospholipid showed obvious difference with habitat, which suggested that there was great difference in the quality of Gekko swinhonis medicinal materials.
6. Reference standards for the content of water, ash and extract of Gekko swinhonis are constructed and the concentration of alcohol for alcohol extract determination is70%according to the results of examination items determination.
7. The infrared spectrum draft of Gekko swinhonis was established for the first time.
8. The ultraviolet fingerprint spectrums group drafts of Gekko swinhonis were established for the first time.
9. The protein fingerprints of total body, body without head and tail of Gekko swinhonis were established for the first time.
10. The HPLC fingerprints of Gekko swinhonis were established for the first time and8common peaks of fingerprints were marked.
11. The results of pharmacodynamic study showed that the Polypeptide and polysaccharide components of Gekko swinhonis had relatively high antineoplastic activity.
12. The quality standards (draft) of Gekko swinhonis were established and foundation for quality control was supplied.
Conclusion
Chinese medicine Gekko swinhonis has relatively high antineoplastic activity, which has been widely used in clinical practice. It hasn't been embodied in Chinese Pharmacopoeia, and there's also no quality evaluation standard, research on the quality control and evaluation hasn't been reported too. In this sense, this research has an initiating significance, which would promote the study on animal drug Gekko swinhonis. This research carried out a systemic and all-around study on the key techniques of quality control and evaluation standard of Chinese medicine Gekko swinhonis for the first time from the aspects of morphological character, microscopic identification and TLC identification, components determination, fingerprinting establishment, examination items determination, pharmacodynamic study, etc. The protein, spectrum and chromatographic fingerprint and the quality standards (draft) of Gekko swinhonis were established for the first time, which laid a foundation for the quality control and evaluation of Chinese medicine Gekko swinhonis.
在传统中医药理论的指导下,结合现代科学技术手段,以中药壁虎为研究对象,通过对收集到的壁虎药材进行系统的本草考证、文献综述、生药学研究、定性定量分析、指纹图谱构建和药效学研究,以期建立动物类中药壁虎的质量控制关键技术和质量评价体系。
主要内容与研究方法
1.本草考证与国内外文献综述——大量查阅历代本草和现代文献,从名称、品种、产地、生境、药用部位、采收加工、炮制、性味归经等方面对中药壁虎进行本草考证,从动物资源、生药学研究、化学成分、药理作用、临床应用等方面对中药壁虎进行国内外文献综述。
2.生药学研究——应用动物分类学知识对收集到的10个产地的壁虎药材进行品种鉴定,并从外部形态、大小、色泽、气味等方面进行药材性状分析,利用粉末显微鉴别技术和有效部位薄层色谱鉴别技术对药材进行生药学鉴定。
3.含量测定研究——通过正交试验优选出壁虎药材蛋白质的提取工艺,利用考马斯亮蓝染色法对不同产地壁虎药材中可溶性总蛋白的含量进行测定；通过正交试验优选壁虎药材多糖的提取工艺,并利用苯酚—硫酸法对不同产地壁虎药材的多糖含量进行测定；测定不同产地壁虎药材的粗脂含量,并采用铝蓝比色法对药材中的磷脂含量进行测定。
4.常规检查项目测定——按照《中国药典》2010年版一部附录规定的方法对不同产地的壁虎药材进行了全面的水分、灰分和浸出物测定分析。
5.指纹图谱研究——利用蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术建立壁虎药材不同部位的蛋白质指纹图谱；利用溴化钾压片法对药材粉末进行红外光谱测定分析；利用紫外谱线组法对药材进行紫外光谱测定分析,建立壁虎药材的紫外谱线指纹图谱；利用高效液相色谱技术优选壁虎药材的HPLC指纹图谱条件,建立壁虎药材的高效液相色谱指纹图谱。
6.药效学研究——提取壁虎药材的多肽和多糖成分,并分别进行体外抗肿瘤实验,用MTT法检测壁虎多肽和多糖成分对人肝癌bel-7402细胞和人乳腺癌MCF-7细胞的杀伤作用。
结果
1.经鉴定本研究应用的壁虎药材均来源于无蹼壁虎(Gekko swinhonis Guenther),不同产地的药材性状及显微特征基本相似,产地间的细微差异可能与壁虎的生活环境、养殖方式、药材加工方法等因素有关。
2.建立了壁虎药材的薄层色谱鉴别方法与检测指标。
3.优选出壁虎药材蛋白提取工艺：pH值为12,料液比为1:20,提取温度为50℃,超声提取时间为80min。不同产地壁虎药材的可溶性蛋白含量有明显差异,因此,蛋白含量可以作为药材质量评价的指标之一。
4.优选出壁虎药材多糖提取工艺：超声提取时间为20min,溶剂量为30倍,醇沉浓度为90%。不同产地壁虎药材的多糖含量有较大差异,因此,多糖含量可以作为药材质量评价的指标之一
5.不同产地壁虎药材的粗脂和总磷脂含量有明显差异,提示药材质量存在差异。
6.根据常规检查项目的测定结果,提出了壁虎药材的水分、灰分和浸出物含量的质量评价参考标准。经实验探讨,确定了壁虎药材醇浸出物测定的乙醇浓度为70%。
7.建立了壁虎药材的红外光谱与紫外谱线组指纹图谱。
8.建立了壁虎药材不同部位的蛋白质指纹图谱。
9.建立了壁虎药材的HPLC指纹图谱,并标定了8个共有特征指纹峰。
10.药效学研究表明,壁虎药材多肽和多糖成分均具有一定的抗肿瘤作用。
11.建立了壁虎药材的质量控制规范(草案),并做出起草说明。
结论
中药壁虎具有较强的抗肿瘤作用,现已广泛应用于临床。该药材未载入《中国药典》,也没有部颁质量标准,目前还未见对其进行相关质量控制与评价的报道。从这个意义上来讲,本研究具有开创性意义,对壁虎药材的现代化研究和开发利用具有很大的促进作用。本课题首次从药材性状、显微鉴定、薄层色谱鉴别、主要成分含量测定、指纹图谱建立、常规项目检查、药效学研究等方面对壁虎药材的质量控制关键技术与评价指标进行了较为系统、全面的研究,建立了壁虎药材的蛋白质指纹图谱、红外和紫外光谱指纹图谱、HPLC指纹图谱,并提出了质量评价标准(草案),为该药材的质量控制与评价奠定了基础。
Objective
Under the guidance of theories of Traditional Chinese Medicine and combining with modern scientific and technological methods, we take Chinese medicine Gekko swinhonis as the research object to establish the key techniques of quality control and evaluation system of animal drug Gekko swinhonis by systematic study of Gekko swinhonis from different habitats from the aspects of herbal textual research, literature review, pharmacognostic studies, qualitative and quantitative analysis, fingerprinting construction and pharmacodynamic study.
Main Research Contents and Methods
1. Herbal textual research and literature review at home and abroad---Herbal textual research on Chinese medicine Gekko swinhonis was done from the aspects of name, variety, habitat, medicinal part, harvest, process and flavor of herbal medicines based on consulting material medica of the past dynasties and modern literatures. At the same time, literatures of Gekko swinhonis at home and abroad were reviewed from the aspects of animal resources, pharmacognostic studies, chemical constituents, pharmacological action and clinical application.
2. Pharmacognostic study---Variety identification was conducted for Gekko swinhonis medicinal materials from10habitats with application of animal taxonomy. And character analysis was conducted from the aspects of external morphology, size, color, smell and so on. Moreover, microscopic identification and TLC were used in pharmacognosy identification of Gekko swinhonis.
3. Components determination---Orthogonal test was employed to optimize the extraction techniques of protein and polysaccharide, and the content of water-soluble protein and polysaccharide of Gekko swinhonis medicinal materials from10habitats were determined using the technology of Coomassie brilliant blue stained and phenol-sulfuric acid method, respectively. Contents of crude fat and total phospholipid were also determined by molybdenum blue colorimetry.
4. Examination items determination---Content of water, ash and extract of Gekko swinhonis from different habitats were determined according to the Chinese Pharmacopoeia in2010.
5. Fingerprint study---Establishing the protein fingerprint of Gekko swinhonis by using polyacrylamide gel electrophoresis. The ultraviolet fingerprint spectrums group draft of Gekko swinhonis were established with the different multi-polar solvent system extract. The infrared spectrum of Gekko swinhonis was established with pressing potassium bromide troche. The chromatographic fingerprint of Gekko swinhonis was established by high performance liquid chromatography.
6. Pharmacodynamic study---Polypeptide and polysaccharide components of Gekko swinhonis medicinal materials were extracted to detect the killing effect of the active extracts on bel-7402(human hepatocellular carcinoma cell line) and MCF-7(human breast cancer cell line) by MTT assay.
Results
1. The medicinal materials in this study are all Gekko swinhonis, the morphological and microscopical characters are similar, and the difference of external morphology maybe due to different living environment, breeding way and processing method, etc.
2. The TLC identification method and detection index of Gekko swinhonis medicinal materials were developed.
3. The optimized extraction technique of protein is:pH12, solid-liquid ratio1'.20and80min for extraction at the temperature of50℃. The content of water-soluble protein of Gekko swinhonis medicinal materials showed obvious difference with habitat, so it can be served as an index of quality evaluation of Gekko swinhonis.
4. The optimized extraction technique of polysaccharide is:20min for extraction, solid-liquid ratio1:30and alcohol concentration of90%. The content of polysaccharide of Gekko swinhonis medicinal materials also showed obvious difference with habitat, so it can be served as another index of quality evaluation of Gekko swinhonis.
5. The content of crude fat and total phospholipid showed obvious difference with habitat, which suggested that there was great difference in the quality of Gekko swinhonis medicinal materials.
6. Reference standards for the content of water, ash and extract of Gekko swinhonis are constructed and the concentration of alcohol for alcohol extract determination is70%according to the results of examination items determination.
7. The infrared spectrum draft of Gekko swinhonis was established for the first time.
8. The ultraviolet fingerprint spectrums group drafts of Gekko swinhonis were established for the first time.
9. The protein fingerprints of total body, body without head and tail of Gekko swinhonis were established for the first time.
10. The HPLC fingerprints of Gekko swinhonis were established for the first time and8common peaks of fingerprints were marked.
11. The results of pharmacodynamic study showed that the Polypeptide and polysaccharide components of Gekko swinhonis had relatively high antineoplastic activity.
12. The quality standards (draft) of Gekko swinhonis were established and foundation for quality control was supplied.
Conclusion
Chinese medicine Gekko swinhonis has relatively high antineoplastic activity, which has been widely used in clinical practice. It hasn't been embodied in Chinese Pharmacopoeia, and there's also no quality evaluation standard, research on the quality control and evaluation hasn't been reported too. In this sense, this research has an initiating significance, which would promote the study on animal drug Gekko swinhonis. This research carried out a systemic and all-around study on the key techniques of quality control and evaluation standard of Chinese medicine Gekko swinhonis for the first time from the aspects of morphological character, microscopic identification and TLC identification, components determination, fingerprinting establishment, examination items determination, pharmacodynamic study, etc. The protein, spectrum and chromatographic fingerprint and the quality standards (draft) of Gekko swinhonis were established for the first time, which laid a foundation for the quality control and evaluation of Chinese medicine Gekko swinhonis.
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