人胰岛素A、B链基因表达载体的构建与大豆遗传转化
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摘要
植物医药生物反应器的设想是在上个世纪八十年代末提出的。由于它在理论上是一个更为简便、廉价、安全、可靠的医用蛋白和多肽生产体系，因此，自二十世纪九十年代以来它受到人们越来越多的关注。一大批医用蛋白和多肽在植物中获得了表达，但是要应用于商业生产还任重道远。本研究通过分析大豆内源蛋白和多肽密码子使用情况，筛选大豆偏爱密码子，人工合成了人胰岛素A、B链基因，并经农杆菌介导转化常规大豆品种“吉30”，为最终人胰岛素基因在大豆中的表达奠定了基础。主要研究结果如下：
1．根据大豆偏爱密码子和GeneBank中的人胰岛素A、B链氨基酸序列，人工合成了人胰岛素A、B链基因。
2．将人胰岛素A、B链基因与含有超表达组成型启动子—CaMV35S启动子的质粒载体pBI121重组构建成植物表达载体pBI121-IN。通过电激法将pBI121-IN转化根癌农杆菌EHA105，获得了PCR检测呈阳性反应的EHA105(pBI121-IN)工程菌。
3．用EHA105(pBI121-IN)工程菌液侵染大豆“吉30”子叶节，通过优化EHA105(pBI121-IN)对“吉30”子叶节遗传转化的各种参数指标，建立了农杆菌EHA105介导的大豆“吉30”子叶节遗传转化体系。
4．通过共培养和抗性筛选获得了能够在含卡那霉素的生根培养基上正常生长的大豆抗性苗。
The theory of plant reactor of medicine was advanced in the end of 1980s. Nowadays,plant reactor have received more and more attention because theoretically, it is a prospective cheaper and safer way to produce medical proteins or polypeptides. A great number of medical proteins or polypeptides were already expressed effectively in plant. But there is a longer way before us before plant reactors are used to produce commercial medical proteins or polypeptides. Here, we synthesized the DNA sequence of A and B strand of human insulin with soybean biased codon after analyzing the soybean codon bias and introduced it into conventional soybean strain. "Ji30" through Agrobacterium-mediated transformation system. Consequently, paved the way for the expression of human insulin gene in soybean. The major results in the paper are abstracted as follows:
1 we synthesized the DNA sequence of A and B strand of human insulin with soybean biased codon after analyzing the soybean codon bias according to the cDNA data of soybean in GeneBank.
2.Insert the above DNA sequence into the pBI121 with CaMV35S and constructed the soybean binary expression vector pBI 121-IN. Then, we i ntroduced pBH21-IN into the cell of Agrobacterium tumefaciens EHA105 and obtain EHA105 (pBI121-IN) which was positive in PCR detection.
3.By optimizing the parameters of co-culture between EHA105 (pBI121-IN) and cotyledonary node of soybean Ji30, we established a effective Agrobacterium EHA105-mediated genetic transformation system of cotyledonary node of Ji30.
4. By the established EHA105-mediated genetic transformation system of Ji30, we obtained Km resistant seedling in rooting medium.
1．根据大豆偏爱密码子和GeneBank中的人胰岛素A、B链氨基酸序列，人工合成了人胰岛素A、B链基因。
2．将人胰岛素A、B链基因与含有超表达组成型启动子—CaMV35S启动子的质粒载体pBI121重组构建成植物表达载体pBI121-IN。通过电激法将pBI121-IN转化根癌农杆菌EHA105，获得了PCR检测呈阳性反应的EHA105(pBI121-IN)工程菌。
3．用EHA105(pBI121-IN)工程菌液侵染大豆“吉30”子叶节，通过优化EHA105(pBI121-IN)对“吉30”子叶节遗传转化的各种参数指标，建立了农杆菌EHA105介导的大豆“吉30”子叶节遗传转化体系。
4．通过共培养和抗性筛选获得了能够在含卡那霉素的生根培养基上正常生长的大豆抗性苗。
The theory of plant reactor of medicine was advanced in the end of 1980s. Nowadays,plant reactor have received more and more attention because theoretically, it is a prospective cheaper and safer way to produce medical proteins or polypeptides. A great number of medical proteins or polypeptides were already expressed effectively in plant. But there is a longer way before us before plant reactors are used to produce commercial medical proteins or polypeptides. Here, we synthesized the DNA sequence of A and B strand of human insulin with soybean biased codon after analyzing the soybean codon bias and introduced it into conventional soybean strain. "Ji30" through Agrobacterium-mediated transformation system. Consequently, paved the way for the expression of human insulin gene in soybean. The major results in the paper are abstracted as follows:
1 we synthesized the DNA sequence of A and B strand of human insulin with soybean biased codon after analyzing the soybean codon bias according to the cDNA data of soybean in GeneBank.
2.Insert the above DNA sequence into the pBI121 with CaMV35S and constructed the soybean binary expression vector pBI 121-IN. Then, we i ntroduced pBH21-IN into the cell of Agrobacterium tumefaciens EHA105 and obtain EHA105 (pBI121-IN) which was positive in PCR detection.
3.By optimizing the parameters of co-culture between EHA105 (pBI121-IN) and cotyledonary node of soybean Ji30, we established a effective Agrobacterium EHA105-mediated genetic transformation system of cotyledonary node of Ji30.
4. By the established EHA105-mediated genetic transformation system of Ji30, we obtained Km resistant seedling in rooting medium.
引文
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