富含核黄素营养酵母的研究
摘要
本论文对酵母胞内核黄素的测定，产核黄素酵母出发菌株的选择，富含核黄素酵母菌株的诱变育种、发酵培养基和发酵工艺条件的优化等进行了研究。
通过对三种核黄素测定方法的比较，表明荧光光度法在测定酵母胞内核黄素含量时，响应值与核黄素含量之间有良好的线性关系，重现性好、准确度高、受提取液体系影响小，是测定酵母胞内核黄素含量最适的测定方法。通过对两种酵母胞内核黄素提取方法的研究表明：高压蒸煮法是一种有效的提取酵母胞内核黄素的方法，能将酵母胞内的核黄素充分提取出来。
对六株酵母菌进行了生长速率、生物量、自溶浸出率、核酸含量以及粗蛋白含量的比较，确定了核黄素含量和自溶率较高，在粗蛋白含量、生长速率、核酸含量等指标比较适中的RY-3菌株作为诱变出发菌株。
通过P-B析因试验，找出了对酵母胞内核黄素积累有显著影响的因子为生物素、磷酸二氢钾、溶氧水平。通过均匀设计试验，对影响酵母生长的微量元素进行了优化，确定了金属离子的最适添加量为：MgSO_4·7H_2O1.1g／L，COSO_4·7H_2O 28mg／L，CuSO_4·5H_2O 0.01mg／L，MnCl_2 0.02mg／L，ZnSO_4·7H_2O 34mg／L，FeSO_4·7H_2O 14mg／L。
对RY-3菌株进行了发酵条件优化试验，试验表明：发酵液的溶氧水平对酵母合成核黄素有显著影响，较高的溶氧水平有利于酵母胞内核黄素的累积。较低的发酵液初始pH值和较小的接种量对RY-3菌株累积胞内核黄素有利。
根据代谢理论对RY-3菌株进行了紫外诱变并结合结构类似物抗性诱变，获得了一株具有8—氮鸟嘌呤抗性和寡霉素抗性的突变株，该菌株的生长速率和核黄素产量显著提高，核黄素产量比原菌株提高了79.97％，可达86.38mg／kg。
In the paper,determination of yeast intraceller riboflavin,selection of parent strain, breeding of yeast pruducing rich intraceller riboflavin as well as optimization of mediun and fermention conditions were studied.
By comparison, it was shown that fluoroscopic method is the most suitable method in determinating intraceller riboflavin because of its good recurrence, veracity, linearity between response and content of riboflavin and is little affected by solution system and high- pressure steaming is a valid method of distilling intraceller riboflavin.
Indices of six strains of yeast including the riboflavin yield, nucleic acid and raw protein, autolytic ratio and biomass, were determined and compared. RY-3 with moderate growth ratio , biomass,nucleic acid and raw protein is choosen for parent strain because of its higher autolytic ratio and riboflavin yield.
The factors with important influence on yeast intraceller riboflavin yield were dicided as biotin,K2HPO4and dissolved oxygen throuth P-B selecting-fator experiment. The optimal concentrations of metal ions in the medium were desided as MgSO4. 7H20 1. 1 g/L, CoSO-i. 7H? 28 mg/L, CuS(k 5H20 0. 01 mg/L, MnCl2O. 02 mg/L, ZnSOt. 7H20 34 mg/L, FeSO4. 7H20 14 mg/L throuth uniform design.
The optimization of fermention conditions suggest that oxygen concertration has distint effect on riboflavin yield and higher oxygen concertration, lower preliminary pH and lesser inoculation is benefitful to riboflavin yield.
A strain with growth ratio and riboflavin yield have been greatly increased is obtained throuth mutation,its riboflavin yield has increased by 79.97%,can reach 86.38 mg/kg.
通过对三种核黄素测定方法的比较，表明荧光光度法在测定酵母胞内核黄素含量时，响应值与核黄素含量之间有良好的线性关系，重现性好、准确度高、受提取液体系影响小，是测定酵母胞内核黄素含量最适的测定方法。通过对两种酵母胞内核黄素提取方法的研究表明：高压蒸煮法是一种有效的提取酵母胞内核黄素的方法，能将酵母胞内的核黄素充分提取出来。
对六株酵母菌进行了生长速率、生物量、自溶浸出率、核酸含量以及粗蛋白含量的比较，确定了核黄素含量和自溶率较高，在粗蛋白含量、生长速率、核酸含量等指标比较适中的RY-3菌株作为诱变出发菌株。
通过P-B析因试验，找出了对酵母胞内核黄素积累有显著影响的因子为生物素、磷酸二氢钾、溶氧水平。通过均匀设计试验，对影响酵母生长的微量元素进行了优化，确定了金属离子的最适添加量为：MgSO_4·7H_2O1.1g／L，COSO_4·7H_2O 28mg／L，CuSO_4·5H_2O 0.01mg／L，MnCl_2 0.02mg／L，ZnSO_4·7H_2O 34mg／L，FeSO_4·7H_2O 14mg／L。
对RY-3菌株进行了发酵条件优化试验，试验表明：发酵液的溶氧水平对酵母合成核黄素有显著影响，较高的溶氧水平有利于酵母胞内核黄素的累积。较低的发酵液初始pH值和较小的接种量对RY-3菌株累积胞内核黄素有利。
根据代谢理论对RY-3菌株进行了紫外诱变并结合结构类似物抗性诱变，获得了一株具有8—氮鸟嘌呤抗性和寡霉素抗性的突变株，该菌株的生长速率和核黄素产量显著提高，核黄素产量比原菌株提高了79.97％，可达86.38mg／kg。
In the paper,determination of yeast intraceller riboflavin,selection of parent strain, breeding of yeast pruducing rich intraceller riboflavin as well as optimization of mediun and fermention conditions were studied.
By comparison, it was shown that fluoroscopic method is the most suitable method in determinating intraceller riboflavin because of its good recurrence, veracity, linearity between response and content of riboflavin and is little affected by solution system and high- pressure steaming is a valid method of distilling intraceller riboflavin.
Indices of six strains of yeast including the riboflavin yield, nucleic acid and raw protein, autolytic ratio and biomass, were determined and compared. RY-3 with moderate growth ratio , biomass,nucleic acid and raw protein is choosen for parent strain because of its higher autolytic ratio and riboflavin yield.
The factors with important influence on yeast intraceller riboflavin yield were dicided as biotin,K2HPO4and dissolved oxygen throuth P-B selecting-fator experiment. The optimal concentrations of metal ions in the medium were desided as MgSO4. 7H20 1. 1 g/L, CoSO-i. 7H? 28 mg/L, CuS(k 5H20 0. 01 mg/L, MnCl2O. 02 mg/L, ZnSOt. 7H20 34 mg/L, FeSO4. 7H20 14 mg/L throuth uniform design.
The optimization of fermention conditions suggest that oxygen concertration has distint effect on riboflavin yield and higher oxygen concertration, lower preliminary pH and lesser inoculation is benefitful to riboflavin yield.
A strain with growth ratio and riboflavin yield have been greatly increased is obtained throuth mutation,its riboflavin yield has increased by 79.97%,can reach 86.38 mg/kg.
引文
[1] 吴思方，方尚玲，周林．啤酒废酵母生产酵母味素的研究[J]．中国酿造，2000，(2)11～13
[2] 王秀道．啤酒酵母的干燥和利用[J]．酿酒科技，1998，(1)：70～71
[3] 徐万祥．维生素发酵[J]．微生物通报，1990，(3)：15～19
[4] 华炳生等．酵母在医药工业中的应用[J]．工业微生物，1986，(3)：39～40
[5] 冯霖，江泉．浅谈我国啤酒厂废弃物综合利用的现状及发展趋势[J]．酿酒科技，1995，(5)：33～34
[6] 诸镇祺．啤酒酵母的开发应用[J]酒良酒，1996，(3)：7～9
[7] 李小全等．法国实用酵母[J]．工业微生物，1988，(10)：33～36
[8] Semard, et al.Process for Brewer's Yeast Debittering.U.S.Pat.NO.571, 665, 3
[9] Yang.Organomatallic-metabolizing yeast. U.S.Pat.NO.6, 140, 107
[10] K.J.Blackwell, I.singleton, J.M.Tobin.Metal Cation Uptake by Yeast: A Review[J].Appl Microbiol Biotechnol, 1995, (43)：579～584
[11] M．阿诺尔德，P．杨．锗酵母膳食营养添加剂．CN．Pat．NO．1177301A
[12] 唐博恒，莫卓寿，黄诗旦．高锗酵母德研究[J]．解放军预防医学杂志，1994，12(3)：179～183
[13] 于志辉，刘力．微量元素营养剂—硒酵母[J]．中国食品工业，1995,000(011)：33～34
[14] 陈远才，方扬帆．营养元素酵母生产工艺．CN．Pat．NO．1066290A
[15] Kawai, et al.Process of the Preparation of Riboflavin. U.S.Pat.NO.4, 794, 081
[16] Heefner,Donald.Efficient Riboflavin Production with Yeast.U.S.Pat.NO.5 , 231, 007
[17] Usui, et al. Process for Producing Riboflavin by Femertation.U.S.Pat.NO.5, 334, 510
[18] 李庆余．维生素B_2生产菌原生质体诱变选育[J]．微生物通报，1990，(4)：23～26
[19] Matsuyama,Akinobu.Process for Preparation of Riboflavin. U.S.Pat.NO.5,126,248
[20] 杜留云，裘娟萍．核黄素在动物中的作用[J]．江西饲料，2002(2)17～19
[21] 梁惠芳，柳启沛．核黄素缺乏对脂质过氧化的影响[J]．中国公共卫生，2000，16(8)：751～752
[22] 王林静．核黄素与健康[J]．广东药学院学报，2000，016(003)：223～228
[23] 贾连旺，杜永远等．核黄素对冠心病无症状心肌缺血影响的动态心电图观察[J]．伤残医学杂志，2002，10(2)54～56
[24] 游云天．核黄素缺乏症87例调查报告[J]．中华皮肤科杂志，1997，(3)52～54
[25] 柳启沛，陆文根．铁、核黄素与贫血关系研究及其防治应用[J]．医学研究通讯，1994，23(10)：29～30
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[27] 吕哲，刘冬丽．慢性肾炎的中西医结合护理体会[J]．辽宁中医杂志，2003，30(5)：415
[28] 王瑞．核黄素有益于性生活[J]．性教育与生殖健康，2001，(3)：15
[29] 李季伦，张伟心等．微生物生理学[M]．北京农业大学出版社1993，304～305
[30] 姜小山，孙国萍．核黄素产生菌阿舒假囊酵母抗反馈抑制突变株的选育[J]．微生物学报，1997，37(2)：95～100
[31] 李庆余，朱宝臣．维生素B_2菌原生质体诱变选育[J]．微生物学报，1990，30(4)：312～313
[32] Foster.Riboflavin Producing Strains Of Microorganisms, U.S Pat. No.5, 120, 655
[33] 程鲁榕．紫外线诱变原生质体选育核黄素高产菌株[J]．微生物学通报，1993，20(1)：19～21
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[36] 董枫莲，薛涛等．食物疗法治愈儿童核黄素缺乏性口角炎[J]．宁夏医学院学报，1998，20(1)：57
[37] 曹克嘉．国内外单细胞酵母工业的发展现状与趋向[J]．天津轻工，1991，(4)：24～26
[38] 郑建仙．功能性食品(第二卷)[M]．中国轻工业出版社，1999：272～278
[39] 程传煊．生物物理化学[M]科学技术出版社，1998，12
[40] 王福荣．工业发酵分析[M]．北京：中国轻工业出版社，1980：6～22
[41] 黄伟坤等．食品检验与分析[M]．轻工业出版社，1989
[42] Felicidad Vallas, M.Teresa Sancho 等 Determination of Total Riboflavin in Cooked Sausages[J].Agric.Food.Chem, 1999, 47, 1067～1070
[43] Ozbas-T, Kutsal-T. Riboflavin production by Eremothecium ashbyii in a batch stirred tank fermentor.[J].Biotechnol Letter, (1896) 8, 6, 441-44
[44] 杜连祥等，工业微生物学实验技术[M]．天津科学技术出版社，1992
[45] Tijen Ozbas, Tulin Kutsal. Effects of growth factor on riboflavin production by Ashbya gossypii.[J].Enzyme Microbiology technology, 1991, (13): 594～596
[46] I.M.Tamer et al, Kinetics of riboflavin production by Brewers' yeasts. [J] Enzyme Microb. Technol., 1988, vol. 10, December
[47] 沈同，王镜岩，杨福愉等 生物化学[M]，高等教育出版社，2002，83～85
[48] Heefner,et al. Method for producing riboflavin with C.famata. US Patent 5164303
[49] Schlee.Physiology and Biochemistry of Riboflavin Formation.[J]Die Pharmazie, 1984.12
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