柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母cDNA文库以及诱饵质粒pGBKT7-EtCDPK3的构建
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- 论文作者：徐帅兵 ; 黄兵 ; 赵其平 ; 董辉 ; 朱顺海 ; 崔晓霞 ; 谢雨翔 ; 唐敏 ; 杨志远 ; 韩红玉
- 年：2016
- 作者机构：中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点实验室;江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心;上海师范大学生命与环境科学学院;
- 论文关键词：酵母双杂交 ; cDNA文库 ; EtCDPK3 ; 诱饵质粒 ; 筛选
- 会议召开时间：2016-08-08
- 会议录名称：中国动物学会寄生虫学专业委员会第十届全国寄生虫学青年工作者学术研讨会论文摘要集
- 英文会议录名称：The Abstracts of the Tenth Symposium for Yong Scientists of China Society of Parasitology
- 语种：中文
- 分类号：S852.723
- 学会代码：JISC
- 会议名称：中国动物学会寄生虫学专业委员会第十届全国寄生虫学青年工作者学术研讨会
- 会议地点：中国四川成都
- 主办单位：中国动物学会寄生虫学专业青年委员会
- 学会名称：中国动物学会寄生虫学专业委员会
- 页数：1
- 文件大小：605k
- 原文格式：D
- 会议级别：全国
摘要
为了筛选柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3(EtCDPK3)相互作用的蛋白,本实验用酵母双杂交系统构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母cDNA文库,同时构建了用于酵母双杂交筛选的诱饵重组质粒p GBKT7-EtCDPK3。首先,提取纯化的子孢子总RNA,经MMLV反转录合成cDNA第一链,利用LD-PCR合成双链c DNA(ds cDNA),经CHROMA SPINT+TE-400柱纯化ds cDNA,剔除小于200bp的片段。将纯化后的dscDNA、pGADT7-Rec及CarrierD NA共转化到酵母Y187感受态细胞中,经缺陷性培养基(SD/-Leu)的筛选即可得到子孢子酵母双杂交c DNA文库。同时,以柔嫩艾美耳球虫子孢子总RNA为模板反转录合成cDNA第一链,利用PCR扩增获得EtCDPK3含ORF的片段,该序列全长1302bp,与诱饵质粒p GBKT7连接,获得重组诱饵质粒p GBKT7-EtCDPK3,经双酶切和测序鉴定正确后转入酵母菌Y2HGold中,并检测了该质粒在酵母Y2HGold内的细胞毒性、自激活活性以及该蛋白表达情况。结果显示,构建的子孢子酵母cDNA文库的转化率为4.33×105cfu/μg,文库容量为3.62×107cfu/mL,插入片段的大小在200bp~2000bp之间,重组率为93.75%。同时,成功构建了重组诱饵质粒pG BKT7-EtCDPK3,在酵母细胞Y2HGold中无细胞毒性和自激活活性,且在Y2HGold中能够表达。结果表明成功构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库,以及重组诱饵质粒p GBKT7-EtCDPK3。为进一步筛选EtCDPK3相互作用蛋白和研究其功能奠定了基础。
引文