毒死蜱染毒撤除诱发原代培养大鼠海马神经元细胞毒性反应延迟
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摘要
目的:毒死蜱(CHLORPYRIFOS,CPF)是目前世界上应用最广泛的有机磷杀虫剂之一,流行病研究资料显示,毒死蜱暴露后能够诱发学习记忆及注意力下降相关的认知功能障碍,而该症状一般在脱离暴露的一段时间后才出现,该毒性作用机制尚不明确。本试验旨在观察染毒撤除后原代培养的大鼠海马神经元的细胞毒性反应。方法:取胎龄为16~18天的胎鼠,消毒后迅速解剖出大脑分离海马,剪碎,胰蛋白酶消化10 MIN后采用分步吹打法获得单细胞悬液,台盼蓝染色计数后以一定的密度接种在预先包被好多聚赖氨酸的细胞培养板中。原代培养海马神经元暴露于浓度为10,30 MMOL·L-1的CPF,连续72 H染毒或染毒48 H后更换无CPF的培养液继续培养24 H,观察细胞形态并运用CCK-8试剂盒和NEUN、BRDU、B III TUBU儿IN免疫荧光染色检测海马神经元的生长和活性。结果:原代培养海马神经元经过CPF10,30 MMOL·L-1连续染毒72 H后,神经元生长状况与对照组相比没有明显的变化,神经元胞体饱满,突触网络清晰可见,无死亡细胞碎片。持续暴露48 H后撤除CPF继续培养24 H,10 MMOL·L-1染毒撤除组显示神经元数目减少,并出现细胞碎片、突触断裂,30 MMOL·L-1染毒撤除组上述情况更加严重。CCK-8检测结果显示,CPF10 MMOL.L-1持续染毒72 H神经细胞的存活率为99.3%;而CPF处理48 H后撤除,继续培养24 H,神经细胞的存活率为67.4%(P<0.01);同样,CPF30 MMOL·L~(-1)持续染毒72 H后神经细胞的存活率为90.2%,而CPF撤除组细胞的存活率为36.9%(P<0.01)。NEUN、BRDU和B III TUBULIN分别为成熟神经元、神经前体细胞和新生神经元的特异性标志物,用免疫荧光染色对NEUN、BRDU和B III TUBULIN阳性细胞进行计数,海马神经元在含有CPF10,30 MMOL·L~(-1)的培养液中持续培养72 H,经BRDU和NEUN免疫荧光双染色,以及BRDU和B III TUBULIN免疫荧光双染色后,神经元数目与对照组相比均没有明显差异;而CPF撤除组结果显示,NEUN、BRDU和B III TUBULIN的阳性细胞数目显著减少。结论:低浓度CPF染毒撤除后诱发大鼠海马神经元延迟性细胞毒性反应,其细胞毒性反应可能非CPF直接毒性作用。
引文