凡纳滨对虾WSSV、IHHNV和CMNV多重PCR检测方法的建立
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摘要
根据偷死野田村病毒(CMNV)的保守基因序列,设计筛选出1对特异性引物CMN279,利用已公布的凡纳滨对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)特异性引物WSS235和IHHN356,建立了一种同时检测WSSV、IHHNV和CMNV的多重PCR检测方法。收集18种病原、健康对虾组织及WSSV、IHHNV、CMNV阳性病料,开展特异性测试,该方法可以特异性扩增出WSSV、IHHNV、CMNV基因片段,健康对虾肌肉组织、其他18种病原均未扩增出任何片段,特异性强。应用克隆方法制备目的基因质粒,应用连续稀释质粒方法开展灵敏度测试,测定该方法检测灵敏度分别为WSSV 9.74fg、IHHNV7.65fg、CMNV 10fg;与已报道的多重PCR检测灵敏度相比较,检测灵敏度提高10倍。应用本研究建立的多重PCR检测方法与实验室标准检验方法同时进行22个样品检验,多重PCR检验方法的检验结果与实验室标准方法检验结果符合率为100%。上述实验结果表明:本研究建立的多重PCR检验方法具有特异性强、灵敏度高、检验时间短、检验结果准确度高的特点,可用于WSSV、IHHNV和CMNV三种病原的快速检测诊断。
引文
[1]丁东,熊云,方勇新,等.WSSV和IHHNV对虾病毒的胶体金免疫层析快速检测[J].水产养殖,2014,35(10):1-7.
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[5]刘飞,张宝存,张晓华,等.对虾6种病毒多重PCR检测方法的建立[J].渔业科学进展,2014,35(1):60-67.
[6]Chamberlain,JS,Gibbs RA,Ranier JE,et al.Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification[J].Nucleic Acids Res,1988,16(23):111-141.
[7]Tsai J M,Shiar L J,Lee H H,et al.Simultaneous detection of white spot syndrome virus(WSSV)and Taura syndrome virus(TSV)by multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)in Pacific white shrimp Penaeus vannamei[J].Dis Aquat Org,50:9-12.
[8]杨冰.对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的检测及其流行情况初步调查[D].青岛:中国海洋大学,2004.
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